Proceso de translocación de membrana revelado por estructuras in situ de secretinas del sistema de secreción tipo II

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4025 (2023) Citar este artículo

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La secretina GspD es el canal de membrana externa del sistema de secreción bacteriano tipo II (T2SS) que secreta diversas toxinas que causan enfermedades graves como la diarrea y el cólera. GspD necesita trasladarse de la membrana interna a la externa para ejercer su función, y este proceso es un paso esencial para que se ensamble T2SS. Aquí, investigamos dos tipos de secretinas descubiertas hasta ahora en Escherichia coli, GspDα y GspDβ. Mediante el promedio del subtomograma de criotomografía electrónica, determinamos las estructuras in situ de los estados intermedios clave de GspDα y GspDβ en el proceso de translocación, con una resolución que oscila entre 9 Å y 19 Å. En nuestros resultados, GspDα y GspDβ presentan patrones de interacción de membrana y formas de transición de la capa de peptidoglicano completamente diferentes. A partir de esto, planteamos la hipótesis de dos modelos distintos para la translocación de membrana de GspDα y GspDβ, proporcionando una perspectiva integral sobre la biogénesis de la membrana interna a externa de las secretinas T2SS.

Los sistemas de secreción, que son complejos proteicos ubicados en la envoltura de las células bacterianas, son utilizados por las bacterias para producir sustratos relacionados con la virulencia que facilitan la supervivencia y la patogenicidad1. Entre los sistemas de secreción, el sistema de secreción tipo II (T2SS) está ampliamente presente y es funcional en especies de proteobacterias, incluidas Escherichia coli (E. coli) no patógena, E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), Vibrio. cholerae, Klebsiella pneumoniae y Aeromonas hydrophila2. Los sustratos de T2SS en bacterias no patógenas pueden facilitar la absorción de nutrientes del medio ambiente o la simbiosis con plantas o animales, mientras que en las bacterias patógenas, los sustratos de T2SS pueden ayudar en la adhesión a los huéspedes, intoxicar las células del huésped y suprimir la inmunidad en el huésped, causando diversas enfermedades3. Dadas las diversas funciones de sustrato del T2SS y su estrecha relevancia para la virulencia y las enfermedades, es necesario conocer su estructura y mecanismo de funcionamiento para comprender las funciones de las bacterias y desarrollar estrategias antimicrobianas.

El componente de la membrana externa del T2SS es la secretina, que constituye una gran estructura de canal, que se conecta al andamio proteico de la membrana interna y controla el último paso del transporte del sustrato2. El análisis filogenético de las secretinas T2SS de especies de Proteobacteria demostró dos tipos: las secretinas de tipo Klebsiella que se encuentran en Klebsiella y Dickeya; y secretinas de tipo Vibrio que se encuentran en Vibrio, ETEC y EPEC4. Las estructuras de los dos tipos de secretina aparecen como canales cilíndricos que contienen los dominios N0-N3, el dominio de secretina con una región de puerta central y el dominio S5,6,7,8,9,10. Pero son diferentes en la región transmembrana: las secretinas de tipo Vibrio tienen alrededor de 20 aminoácidos adicionales entre las hélices α7 y α8, formando un bucle que se extiende hacia arriba y hacia adentro hasta el eje central del canal como un techo, constituyendo una puerta de tapa. mientras que las secretinas tipo Klebsiella no tienen puerta cap5,6,7,8,9,10. Esto provoca directamente diferencias en la altura de las regiones transmembrana propuestas de los dos tipos de secretina, lo que puede darles diferentes formas de interactuar con la membrana. La estructura in situ de T2SS se ha visualizado en Legionella pneumophila, lo que ha indicado la arquitectura de T2SS y la interacción de membrana de la secretina11. Sin embargo, la resolución se limita a unos pocos nanómetros, lo que dificulta la observación de más detalles de la estructura. El estudio de estructuras de alta resolución de secretinas in situ podría revelar posibles procesos biológicos que ocurren en el entorno celular y ofrecer una comprensión más completa de su proceso y mecanismos de ensamblaje. Este entorno no se puede simular con precisión in vitro y puede tener un impacto significativo en el comportamiento de la secretina.

La translocación de secretinas de T2SS desde la membrana interna a la membrana externa es un paso esencial requerido para el ensamblaje de T2SS; sin embargo, aún no está claro cómo se regula esta translocación en la envoltura de la célula bacteriana. Según experimentos de bioquímica, existen dos vías posibles: (1) las proteínas de andamiaje GspA y GspB se unen y aumentan el tamaño de los poros del peptidoglicano, y translocan la secretina a la membrana externa, como se encuentra en las secretinas de tipo Klebsiella ExeD y OutD12,13. ,14; (2) una pequeña pilotina GspS podría unirse al dominio S de la secretina, y la propia pilotina puede translocarse a la membrana externa a través de la vía de clasificación Lol, como se encuentra en las secretinas de tipo Vibrio4,15,16. Además de estas dos vías, dado que algunos T2SS existen sin GspA y GspB o la pilotina11,17,18, posiblemente también existan otras vías. A pesar de la evidencia bioquímica actual, este proceso de translocación no se ha visualizado en células vivas. Al realizar estudios de criotomografía electrónica in situ (crio-ET) en secretinas T2SS, capturamos diferentes estados intermedios durante el proceso de translocación de la membrana externa, lo que ayuda a explicar el mecanismo de translocación y proporciona un modelo más claro del proceso de biogénesis de las secretinas T2SS.

Hay dos secretinas T2SS codificadas en dos operones T2SS en el genoma de E. coli: la GspDα de tipo Klebsiella codificada en el operón T2SSα que puede secretar quitinasa19,20,21,22, y representa funciones no patógenas; y el GspDβ de tipo Vibrio codificado en el operón T2SSβ4,15, que puede secretar toxinas23,24, que representan funciones patogénicas. En este estudio, investigamos las estructuras in situ de GspDα de la cepa E. coli K12 y GspDβ de la cepa ETEC H10407 como representantes de las secretinas de tipo Klebsiella y secretinas de tipo Vibrio, respectivamente. Informamos cuatro estados estructurales in situ de complejos específicos de secretina/secretina-pilotina, determinados dentro de las células de E. coli, utilizando el promedio del subtomograma crio-ET. Son, respectivamente, GspDα en la membrana interna, GspDα en la membrana externa, complejo GspDβ-GspS en la membrana externa y GspDβ en la membrana interna (Tabla complementaria 1). Juntas, estas estructuras muestran interacciones de secretinas con membranas internas y externas y brindan información sobre el proceso de biogénesis de la secretina GspD.

Para obtener células delgadas para mejorar el contraste bajo crio-ET, empleamos un sistema de minicélulas de bacterias para proporcionar células delgadas que retengan actividades fisiológicas25. Indujimos la sobreexpresión de GspDα dentro de las células E. coli BL21 (DE3) (Fig. 1j). Se realizó Cryo-ET para obtener imágenes de las minicélulas y se recolectaron 250 series de inclinación. A partir de las imágenes de inclinación sin procesar y las tomografías reconstruidas, se pudieron reconocer claramente las características celulares, incluida la envoltura celular bacteriana intacta y las partículas de GspDα unidas a la membrana (Fig. 1a-d). En las tomografías se pudieron identificar partículas de multímero de GspDα en diferentes orientaciones con respecto al plano de la rejilla y, sorprendentemente, en estas condiciones experimentales, las partículas de GspDα están ubicadas naturalmente en la membrana interna de la envoltura bacteriana, con los dominios no transmembrana mirando hacia el frente. espacio periplásmico (Fig. 1d). Como GspDα tiene una forma aproximadamente cilíndrica, identificamos partículas en la vista superior y lateral como en círculos y un par de líneas curvas unidas a la membrana interna, respectivamente. Las imágenes de las células de control negativo validaron aún más que estas características de partículas encontradas en las tomografías pertenecen a nuestra proteína de interés (Figura 1 complementaria).

a Vista del corte z del tomograma de E. coli que sobreexpresa GspDα. b Segmentación de la tomografía que se muestra en (a), con OM de color púrpura, PG de color amarillo, IM de color rojo oscuro y GspDα en IM de color azul. c Ampliar la vista de corte z del tomograma de las partículas GspDα de la vista superior. d Ampliar la vista del corte z del tomograma de las partículas de GspDα de vista lateral, indicadas por puntas de flecha blancas con contorno azul. e – g Cortes de tomograma z que muestran GspDα inclinado en la membrana interna o GspDα con solo un lado conectando la membrana interna (puntas de flecha blancas con contorno azul). Las membranas externa e interna están indicadas por la línea violeta y la línea roja oscura, respectivamente. h Una vista de corte z de tomografía de E. coli que sobreexpresa GspDα y con D-metionina añadida (la partícula de GspDα en el OM se indica mediante una punta de flecha blanca con un contorno verde). i Segmentación de la tomografía que se muestra en h, con OM de color púrpura, PG de color amarillo, IM de color rojo oscuro, GspDα en IM de color azul y GspDα en OM de color verde. j Resultados de inmunotransferencia de la sobreexpresión de GspDα mediante el uso de anticuerpos anti-etiqueta His. Se utilizaron como control células BL21 (DE3) (WT) sin transformación de plásmido. k, Las fracciones de membrana interna y externa de las células que sobreexpresan GspDα tratadas con/sin D-metionina se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La ubicación de la membrana de GspDα se inmunotransfirió con anticuerpos anti-etiqueta His. l Las proteínas de la membrana externa de las células que sobreexpresan GspDα tratadas con/sin D-metionina se extrajeron utilizando un kit de extracción de proteínas de membrana bacteriana. La GspDα total y la GspDα de la membrana externa se examinaron mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-etiqueta His. Los experimentos de expresión y ubicación de membrana de GspDα se repitieron tres veces de forma independiente con resultados similares. Membrana interna IM, membrana externa OM, peptidoglicano PG, D-Met D-metionina, tipo salvaje WT. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para promediar el subtomograma, se recogieron manualmente ~32 000 partículas y el procesamiento de datos se llevó a cabo utilizando EMAN226. En una serie de estructuras in vitro previas se ha comprobado que la secretina tiene simetría C155,7,9,27,28. Sin embargo, no se ha verificado la simetría de la secretina in vivo. Para confirmar la simetría de nuestras partículas, desarrollamos un algoritmo para medir el radio de partículas individuales y generamos un histograma para buscar radios múltiples potenciales (Figura complementaria 2). El histograma muestra solo un pico con un diámetro consistente con la estructura C15 de GspDα (PDB: 5WQ7), lo que implica fuertemente que hay solo un diámetro de partículas de GspDα in situ en la membrana interna, correspondiente a su estructura C15. Un desafío en la alineación de la secretina en el subtomograma es que, debido a la falta de características de baja resolución a lo largo del eje de simetría, en la etapa inicial de determinación de la orientación, es difícil distinguir las partículas de la vista superior de las de la vista inferior sin información sobre la posición de la membrana. Por lo tanto, al comienzo del refinamiento del subtomograma, muchas partículas de la vista superior estaban desalineadas y colocadas al revés, lo que limitaba la resolución final y provocaba que el mapa reconstruido inicial exhibiera algunas características simétricas "D" (simetría a lo largo del plano central x-y). ) además de la simetría de 15 veces. Para resolver esta ambigüedad, desarrollamos un algoritmo en el paquete de tomografía EMAN2, que considera la ubicación geométrica de la membrana celular como un factor adicional en la determinación de la orientación de las partículas (ver "Métodos"). El uso de esta metodología mejoró tanto las características visibles en el mapa como la resolución medida (Figuras complementarias 3b, c).

El promedio final del subtomograma simetrizado C15 logró una resolución medida de 9 Å (Figura complementaria 4a), demostrada por cierta visibilidad de las hélices alfa en el mapa (Figura complementaria 5b, Película complementaria 1). La bicapa de la membrana interna está claramente resuelta y es visible en la parte inferior de este mapa de densidad. Por encima de la bicapa de la membrana interna se encuentra la proteína en forma de carrete (cilindro con un diámetro mayor en ambos extremos) con una superficie adyacente a la membrana sellada y una superficie distal de la membrana abierta. Los dominios N0 – N3 se pueden reconocer claramente en el mapa de densidad (Figura complementaria 5b). En los dominios N1 y N2, las dos capas de hélices alfa apenas se resuelven, de acuerdo con la resolución medida del mapa. Con la posición de los dominios N identificada, la región transmembrana de GspDα se puede modelar aproximadamente utilizando la longitud del dominio de secretina. La punta de GspDα (α7 – β11, β14 y la región enterrada en la membrana de β10 y β155) transita a través de una valva de la bicapa lipídica pero no penetra ni genera una abertura en la membrana (Figura complementaria 5b). El extremo sellado del cilindro corresponde a la región de entrada de la secretina. La densidad de conexión entre la proteína y la membrana interna parece tener una ocupación muy baja según el bajo umbral de isosuperficie requerido para visualizarla. Por lo tanto, interpretar esta conexión requirió un esfuerzo adicional.

Como tanto la membrana como las partículas de GspDα se resuelven claramente en la tomografía sin procesar, pudimos observar directamente que algunas partículas estaban ligeramente inclinadas con respecto a la membrana, en lugar de ser perpendiculares a la membrana (Fig. 1e-g). Para confirmar aún más la conexión de membrana de GspDα, utilizando el mapa de densidad C15 y la información de orientación correspondiente de cada partícula, generamos una estructura asimétrica relajando la simetría (Figura complementaria 3e, f) (ver "Métodos"), produciendo una estructura con una resolución reducida de 15 Å (Figura complementaria 5d). En este mapa de densidad, las valvas de la membrana interna todavía están resueltas, como se esperaba, y GspDα constituye la densidad cilíndrica contraída en el medio. La densidad de conexión de la membrana ahora es claramente visible con aparente ocupación total, pero solo en un lado del cilindro. La conexión de la membrana cubre un arco de aproximadamente 100°, dependiendo del nivel del umbral, por lo que cuando se une a la membrana interna, GspDα solo está parcialmente conectado. Cuando se aplica la simetría C15 a lo largo del eje cilíndrico, esta conexión parcial se promedia, lo que produce la ocupación aparente más baja en la estructura simetrizada original (Figura complementaria 5b).

Además, realizamos un refinamiento enfocado en la región proteica, excluyendo la membrana, y comparamos la orientación de las partículas con la del resultado del refinamiento integrado (Figura complementaria 3g) (ver "Métodos"). Luego se puede determinar para cada partícula la diferencia de orientación entre los dos refinamientos. Al clasificar estas diferencias, recuperamos una trayectoria para GspDα en la membrana interna, donde el multímero oscila alrededor del sitio de contacto de la membrana (Película complementaria 2). Mostramos las conformaciones de los dos puntos finales para esta trayectoria (Fig. 2b, c): en la conformación A, el eje de simetría de GspDα es perpendicular a la membrana; y en la conformación B, el eje de simetría de GspDα está inclinado 2,86° en comparación con la conformación A.

a La estructura in situ de GspDα en la membrana externa, que muestra la vista del corte central y la vista lateral. Los dominios secretina, N3, N2, N1 y N0 están marcados con líneas discontinuas. b, c Las estructuras in situ de la conformación A y la conformación B de GspDα en la membrana interna respectivamente, que muestran la vista del corte central y la vista lateral. Los mapas de densidad están ajustados por la estructura in vitro de GspDα (PDB: 5WQ7). Membrana exterior OM, membrana interior IM.

En resumen, estos resultados indican que el multímero GspDα no está integrado en la membrana interna bacteriana. En cambio, solo forma una conexión suelta con movilidad significativa, lo que facilita su transporte posterior a la membrana externa (ver “Discusión”).

Nuestra hipótesis es que el multímero GspDα está en la membrana interna debido a la existencia del peptidoglicano, que es una red cuyo tamaño de poro es demasiado pequeño para que el multímero GspDα lo atraviese y se transloque a la membrana externa. Intentamos reducir el entrecruzamiento de peptidoglicano para ver si esto facilitaría la focalización de GspDα en la membrana externa. En estudios anteriores, se demostró en Aeromonas hydrophila que la disminución de la reticulación del peptidoglicano por la glicina podría localizar la secretina ExeD en la membrana externa12,13. La evidencia bioquímica también demostró que el crecimiento de E. coli en medios que contienen una alta concentración de D-metionina disminuye el entrecruzamiento del peptidoglicano de E. coli29, cuyo mecanismo incluye tanto la incorporación de D-metionina a los muropéptidos como la D-metionina. influyendo directamente en la remodelación de peptidoglicanos. Por lo tanto, cultivamos minicélulas de E. coli en medio LB que contenía D-metionina 40 mM, indujimos la expresión de GspDα y descubrimos que esto aumentaba la proporción de GspDα en la membrana externa en comparación con el control (Fig. 1k, l). Dentro de las tomografías, observamos partículas de GspDα ubicadas tanto en la membrana externa como en la membrana interna (Fig. 1h, i). Para promediar subtomogramas, solo seleccionamos partículas en la membrana externa. Había 309 partículas, lo que llevó a un refinamiento final con simetría C15 con una resolución de 16 Å (Figura complementaria 4b). Dentro del mapa de densidad, la bicapa de la membrana exterior se resuelve nuevamente con una densidad adyacente en forma de carrete. La superficie adyacente a la membrana del cilindro está sellada, lo que indica la región de la compuerta. Los dominios N0, N1, N2 y N3 podrían reconocerse desde la membrana distal al lado adyacente a la membrana del cilindro (Fig. 2a).

Para investigar más a fondo las interacciones proteína-membrana, relajamos la simetría C15 como anteriormente para GspDα en la membrana interna. El mapa de densidad resultante, visto desde la sección transversal en la conexión de la membrana, muestra que GspDα se conecta a la membrana con una distribución uniforme de ocupación en el contorno de la periferia del cilindro (Figura complementaria 5c), en lugar de la conexión unilateral observada. en la membrana interna (Figura complementaria 5d). Para examinar la simetría de GspDα en la membrana externa, hicimos un refinamiento imponiendo solo simetría C5. Si la estructura tiene simetría C15, debería mostrar 3 repeticiones estructurales dentro de una unidad de simetría C5. El mapa de densidad resultante conserva características simétricas claras de C15 (Figura complementaria 5e), lo que confirma la simetría de GspDα in situ. A modo de comparación, hicimos un refinamiento de C5 en el GspDα en el conjunto de datos de la membrana interna, y el mapa de densidad resultante no manifestó características claras de C15 (Figura complementaria 5f). En conjunto, estos resultados muestran que aumentar el tamaño de los poros del peptidoglicano agregando D-metionina cuando se cultiva E. coli permite que GspDα se transloque a la membrana externa, donde GspDα adopta una conformación más consistente y forma una conexión distribuida uniformemente con la membrana.

GspDβ, como homólogo de GspDα, tiene una estructura similar excepto por una puerta de tapa adicional en el lado adyacente a la membrana5,8, que puede generar diferentes regiones transmembrana e interacciones de membrana. Además, GspDβ tiene un mecanismo de direccionamiento a la membrana externa diferente. En lugar de utilizar proteínas de andamiaje o aumentar el tamaño de los poros del peptidoglicano, una pequeña proteína GspS, denominada pilotina, podría unirse al dominio S de GspDβ y translocar GspDβ a la membrana externa4,15. Por lo tanto, para visualizar partículas de GspDβ en la membrana externa y verificar si GspS forma un complejo con GspDβ allí, realizamos dos experimentos. Una es que la expresión de GspDβ y GspS se inducen en minicélulas de E. coli de tipo salvaje, la otra es que solo se induce la expresión de GspDβ en minicélulas de E. coli de tipo salvaje y se verificó la expresión de la proteína (Fig. 3h) .

a Vista del corte z del tomograma de E. coli que sobreexpresa GspDβ y GspS. b La estructura in situ del complejo GspDβ-GspS en la membrana externa cuando tanto GspDβ como GspS están sobreexpresados, que muestra la vista lateral y la vista del corte central. c, d Vistas de cortes del tomograma z de E. coli que sobreexpresa solo GspDβ. e La estructura in situ del complejo GspDβ-GspS en la membrana externa cuando solo se sobreexpresa GspDβ, que muestra la vista lateral y la vista del corte central. f Vista del corte z del tomograma de ∆gspS E. coli que sobreexpresa GspDβ. g La estructura in situ del multímero GspDβ en la membrana interna, que muestra la vista lateral y la vista del corte central. Las partículas en las membranas externa e interna están indicadas por puntas de flecha blancas con un contorno rojo y puntas de flecha blancas con un contorno amarillo, respectivamente. Los mapas de densidad están equipados con la estructura in vitro del complejo GspDβ-GspS (PDB: 5ZDH). Los dominios secretina, N3, N2, N1 y N0 están marcados con líneas discontinuas. h Resultados de inmunotransferencia de la sobreexpresión de GspDβ y GspS mediante el uso de anticuerpos anti-His. Se utilizaron como control células BL21 (DE3) (WT) y células BW25113-ΔgspS (ΔgspS) sin transformación de plásmido. i Detección de la ubicación de GspDβ en la membrana mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa seguida de análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-etiqueta His (las cepas de bacterias están marcadas a la izquierda y todas las bandas corresponden a GspDβ). Los experimentos de expresión y ubicación de membrana de GspDβ se repitieron tres veces de forma independiente con resultados similares. Membrana interna IM, membrana externa OM, tipo salvaje WT. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En las tomografías reconstruidas de células expresadas en GspDβ-GspS, todas las partículas se encuentran en la membrana externa (Fig. 3a), verificada mediante un experimento de separación de membranas (Fig. 3i). Encajonamos 514 partículas de subtomograma y el refinamiento con simetría C15 logró una resolución de 19 Å (Figura complementaria 4c). Para verificar la simetría, hicimos un refinamiento con la simetría C5 aplicada, y el mapa de densidad resultante aún muestra características C15 (Figura complementaria 6a), lo que confirma que GspDβ in situ tiene simetría C15. En el mapa de densidad (Fig. 3b), la densidad de la membrana exterior es visible como la capa superior. Debajo de la membrana exterior se encuentra la densidad en forma de carrete, similar a la de GspDα. La superficie adyacente a la membrana de la densidad del cilindro está sellada, lo que indica la región de la compuerta. En particular, se puede ver una densidad adicional que aparece como 15 grumos que se conectan a la membrana adyacente a la periferia del cilindro. Estas densidades adicionales probablemente pertenecen a GspS, lo que indica que GspDβ en la membrana externa existe en un complejo con GspS. La estructura in vitro del complejo GspDβ-GspS (PDB: 5ZDH) podría encajar bien en el mapa de densidad y, según la posición de la densidad de la membrana, la región transmembrana podría ubicarse en α7-α10, β11-β14 y la región enterrada en la membrana de β10 y β155,8. A diferencia de GspDα, que solo transita a través de una valva de la membrana, GspDβ transita a través de dos valvas de la bicapa lipídica, con la puerta de la tapa adicional en contacto con la valva externa de la membrana externa.

Esperamos que en las células donde solo se expresa GspDβ, las partículas estén en la membrana externa, ya que debería haber expresión endógena de GspS en la cepa E. coli BL21 (DE3). Observadas en las tomografías, la mayoría de las partículas están en la membrana externa (Fig. 3c), pero sorprendentemente, se ven algunas vistas laterales de partículas en la membrana interna (Fig. 3d), lo cual se verificó con un experimento de separación de membranas (Fig. 3i). ). Dentro de este conjunto de datos, se seleccionaron 910 partículas, incluida una mezcla de partículas ubicadas en la membrana interna y externa. Después de una ronda de refinamiento, realizamos una clasificación de referencias múltiples con dos referencias giradas 180° entre sí, lo que produjo dos poblaciones de partículas con una proporción de 723 partículas de membrana externa a 187 partículas de membrana interna. Usamos las 723 partículas para hacer el refinamiento con simetría C15 y logramos una estructura de resolución de 16 Å (Fig. 3e y Fig. complementaria 4d). También se realizó el refinamiento con simetría C5 y el mapa de densidad mostró características de C15 (Figura complementaria 6b). Esta estructura básicamente se parece a la del conjunto de datos expresados con GspDβ-GspS (Fig. 3b), pero en particular, la densidad de GspS todavía se ve fuera del canal de GspDβ, apareciendo como grumos que se conectan a la superficie del cilindro, aunque no indujimos la sobreexpresión de GspS.

En conjunto, estos resultados indican que, cuando GspS se sobreexpresa junto con GspDβ, forman un complejo en la membrana externa. Sin expresión exógena de GspS, cuando se expresa GspDβ, la GspS endógena de E. coli es suficiente para localizar GspDβ en la membrana externa, donde GspS permanece unida a GspDβ.

Como los resultados de bioquímica han demostrado que GspDβ podría formar multímeros en la membrana interna cuando se elimina gspS 4, 15, para visualizar GspDβ en la membrana interna, indujimos la expresión de GspDβ dentro de las células ΔgspS E. coli (Fig. 3h). Dentro de las tomografías reconstruidas, todas las partículas se visualizan en la membrana interna, con los dominios no transmembrana ubicados en el periplasma (Fig. 3f, i). Hay 370 partículas, y el refinamiento con simetría C15 logró una estructura de resolución de 14 Å (Figura complementaria 4e), lo que genera GspDβ en la membrana interna (Figura 3g). La densidad de la membrana podría ubicarse en la parte inferior, y la densidad del cilindro aparece arriba, insertada en la membrana. La obturación en el extremo inferior del cilindro corresponde a la zona de la compuerta. El extremo inferior de GspDβ transita a través de dos valvas de la membrana interna y no se observa densidad de GspS fuera de la densidad del cilindro. Estos resultados indican que, cuando se elimina gspS, GspDβ podría autoensamblarse en un multímero que tiene una conformación estable en la membrana interna.

En este estudio, mostramos las estructuras in situ de la secretina GspDα del T2SS bacteriano y sus interacciones con las membranas interna y externa. Mostramos que: (1) GspDα podría autoensamblarse en su forma multimérica en la membrana interna sin sobreexpresión de ninguna otra proteína (Fig. 1d); (2) El multímero GspDα forma conexiones flexibles con la membrana interna y no genera una abertura en la membrana interna (Fig. 2b, c); (3) el tamaño normal de los poros del peptidoglicano no alterado no permite el paso de un multímero de GspDα30; (4) existen multímeros disociativos de GspDα en el periplasma de E. coli que expresa GspDα, pero solo entre el peptidoglicano y la membrana interna (Figuras complementarias 7a-c); (5) La D-metionina podría reducir el entrecruzamiento de peptidoglicanos29, y agregar D-metionina al elevar E. coli podría localizar GspDα en la membrana externa (Fig. 1h); (6) existen multímeros disociativos de GspDα en el periplasma de E. coli criado con D-metionina y que expresan GspDα (Figura complementaria 7d); (7) GspDα en la membrana externa existe en una conformación más estable, muestra una simetría distinguible y forma conexiones distribuidas uniformemente con la membrana externa (Figuras complementarias 5c, e). En conjunto, esta evidencia apoya un modelo de translocación en el que GspDα forma primero multímeros en la membrana interna, donde permanece en un estado intermedio, inestable y oscilante, lo que podría favorecer su transporte a la membrana externa. Cuando la D-metionina agranda el poro del peptidoglicano, el multímero se traslada a la membrana externa sin desensamblarse. En la membrana exterior, existe en una conformación consistente, firmemente adherida a la membrana, lo que potencialmente facilita el transporte del sustrato (Fig. 4a). En particular, en nuestros datos, después de tratar células de E. coli con D-metionina, no todas las partículas de GspDα se encuentran en la membrana externa. Este resultado indica que posiblemente existan otras vías o factores para ayudar a que GspDα se transloque a la membrana externa, como las proteínas GspA y GspB codificadas en el operón T2SSα. Reconocemos que los resultados del estado asociado a la membrana interna se observan en bacterias con sobreexpresión y que los estados que observamos pueden no representar el escenario exacto que ocurre en una célula bacteriana no manipulada.

a En primer lugar, GspDα forma multímeros en la membrana interna y adopta una conformación inestable y oscilante, cambiando entre la conformación A (azul claro) y la conformación B (azul oscuro). El multímero podría disociarse de la membrana interna y entrar en el periplasma (modelo de dibujos animados de color azul claro), pero no podría atravesar el peptidoglicano e insertarse en la membrana externa. Cuando la D-metionina aumenta el tamaño de los poros del peptidoglicano, el multímero se traslada a la membrana externa, donde existe en una conformación más estable (verde). b GspDβ primero forma multímeros en la membrana interna (amarillo); luego la pilotina GspS (rosa) se acerca y se une al monómero GspDβ, transportándolo a la membrana externa. En la membrana externa, GspDβ se ensambla nuevamente en un multímero y GspS permanece asociado, formando un complejo multímero GspDβ-GspS (rojo claro). Membrana interna IM, peptidoglicano PG, membrana externa OM, D-Met D-metionina.

Observamos estructuras multiméricas de GspDβ tanto en las membranas bacterianas internas como externas. Mostramos que: (1) cuando se elimina gspS en E. coli, GspDβ forma multímeros en la membrana interna (Fig. 3f, g) 4; (2) cuando gspS no se elimina ni se sobreexpresa en E. coli, todavía se encuentra una pequeña cantidad de multímeros de GspDβ en la membrana interna (Fig. 3d); (3) el tamaño normal de los poros del peptidoglicano no alterado no permite el paso de los multímeros de GspDβ30; (4) cuando existe GspS, ya sea por sobreexpresión del vector o por expresión del genoma endógeno, los multímeros de GspDβ se encuentran en la membrana externa (Fig. 3a, c), incluso si el peptidoglicano no está alterado; (5) GspS se une al monómero GspDβ en una proporción de 1:18; (6) La propia GspS es una lipoproteína que podría translocarse de la membrana interna a la externa a través de la vía Lol15; (7) no observamos multímeros de GspDβ disociados en el periplasma; (8) Los multímeros de GspDβ en la membrana externa existen en un complejo con GspS, es decir, GspS no se disocia después del transporte de GspDβ a la membrana externa (Fig. 3b, e). Con base en lo que observamos, propondríamos un modelo de translocación en el que primero la GspDβ se autoensambla en multímeros en la membrana interna, luego la GspS en la membrana interna se une a la GspDβ, que se disocia en monómeros. Luego, GspS transporta GspDβ a la membrana externa, donde GspDβ se ensambla nuevamente en multímeros con GspS asociado, formando un complejo multímero GspDβ-GspS (Fig. 4b). Debido a las limitaciones de las observaciones crioET, no visualizamos directamente el proceso de los multímeros de GspDβ en la membrana interna que se disocian en monómeros y entran al periplasma con GspS unido. Se necesitan más investigaciones para proporcionar evidencia de este proceso.

En nuestras estructuras, la región transmembrana de GspDα solo está enterrada dentro de una valva de la membrana, en lugar de penetrar la membrana. Este patrón transmembrana es inesperado y biofísicamente irrazonable, pero puede observarse claramente en nuestras estructuras crio-ET. En particular, se ha visualizado la estructura in situ de todo el T2SS11 y se ha indicado que la secretina de Legionella pneumophila, una secretina de tipo Klebsiella basada en el análisis filogenético de la secretina4, también perfora una sola valva de la membrana externa. Se ha sugerido que la región transmembrana de la secretina puede tener una conformación más extendida in vivo basándose en estos hallazgos. Se necesitan más investigaciones para explicar por qué podría existir esta interacción de membrana y cuál es la conformación in vivo que hace posible este tipo de patrón transmembrana.

Al comparar las estructuras ubicadas en la membrana interna y externa de GspDα y GspDβ, observamos que GspDα solo transita por una valva de la bicapa lipídica, pero GspDβ transita por ambas valvas (Figura complementaria 8). Esta diferencia podría darle a GspDβ una mayor eficiencia en el transporte de sustratos. En el genoma de E. coli, hay dos operones del gen T2SS, T2SSα y T2SSβ. Durante la evolución, el T2SSβ puede generarse mediante la duplicación genética del operón T2SSα. Sin embargo, T2SSα está silenciado endógenamente, mientras que T2SSβ se expresa activamente y es funcional15. Nuestro resultado podría proporcionar una posible explicación, es decir, la posiblemente mayor eficiencia de transporte de sustrato le da a GspDβ una ventaja durante la evolución, convirtiéndolo en el T2SS preferido y expresado en muchas bacterias.

En resumen, determinamos cuatro estructuras in situ de la secretina T2SS: las estructuras de membrana interna y externa de GspDα y GspDβ. GspDα existe de forma inestable en la membrana interna, pero forma conexiones firmes y estables con la membrana externa. El multímero GspDβ existe en la membrana interna de E. coli de tipo salvaje, y el GspDβ en la membrana externa existe junto con GspS. En conjunto, estos resultados aumentan el conocimiento de las interacciones de membrana de las secretinas T2SS y su proceso de direccionamiento a la membrana externa, proporcionando un modelo integral para el proceso de biogénesis de secretina de las proteobacterias.

La cepa de E. coli BW25113-ΔgspS se obtuvo del Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara en Japón, de la colección Keio31,32. La cepa E. coli BL21 (DE3) -ΔgspS fue construida por Ubigene Biosciences Co., Ltd. (Guangzhou, China). Las secuencias de ADN que codifican GspDα (cepa E. coli K12), GspDβ (cepa ETEC H10407) y GspS (cepa ETEC H10407) fueron sintetizadas por General Biosystems Co., Ltd. (Anhui, China). La D-metionina se adquirió de Sigma (número de catálogo: M9375-5G).

La gspDα de la cepa K12 de E. coli sin etiqueta o con una etiqueta de hexahistidina C-terminal se clonó en pETDuet-1, produciendo pETDuet-gspDα y pETDuet-gspDα-his, que se expresaron en E. coli BL21 (DE3). respectivamente. El vector sin etiqueta se usó para imágenes crio-ET y el vector con la etiqueta de hexahistidina se usó para realizar pruebas bioquímicas. La gspDβ de la cepa ETEC H10407 con etiqueta de hexahistidina en el terminal C se insertó en pETDuet-1, produciendo pETDuet-gspDβ-his, que se expresó en E. coli Rosetta (DE3) y se usó para imágenes crio-ET y se expresó en E. coli BL21 (DE3) para experimentos de bioquímica. El gen de gspS se clonó en pETDuet-gspDβ-his con una etiqueta de hexahistidina en el extremo C terminal, produciendo pETDuet-gspDβ-his-gspS-his, que se expresó en E. coli BL21 (DE3) y se usó para los experimentos de bioquímica. Tanto el gspDβ con etiqueta de hexahistidina como el gspS sin etiqueta de la cepa ETEC H10407 se insertaron en los dos sitios de clonación múltiple de pETDuet-1, produciendo pETDuet-gspDβ-his-gspS, que se expresó en E. coli BL21 (DE3) y se usó para Imágenes crio-ET. La gspDβ de la cepa ETEC H10407 con etiqueta de hexahistidina se insertó en pBAD, produciendo pBAD-gspDβ-his, que se expresó en la cepa BW25113-ΔgspS y se usó para imágenes crio-ET, y se expresó en la cepa BL21 (DE3)-ΔgspS y se usó. para experimentos de bioquímica. Para los experimentos de imágenes crio-ET, obtuvimos minicélulas cotransformando las cepas de E. coli con pBS58, lo que aumenta la frecuencia de la división celular al expresar constitutivamente genes relacionados con la división celular33. El espesor de minicélula obtenido oscila entre 130 y 250 nm. Como células de control negativo se utilizaron células de E. coli sólo transformadas con pBS58 y no con ningún vector de expresión de proteínas.

Las células se cultivaron a 37 °C en medio LB suplementado con antibióticos apropiados (concentraciones finales de 100 µg/ml de ampicilina y/o 50 µg/ml de kanamicina) y D-metionina 40 mM cuando fue necesario. La expresión de proteínas se indujo a una DO600 de 0,8, añadiendo IPTG 0,5 mM o arabinosa al 0,02% a 20 °C durante la noche. La expresión de proteínas se examinó mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos anti-etiqueta His. Para experimentos con GspDα, los anticuerpos anti-etiqueta His se diluyeron 10.000 veces. Para experimentos con GspDβ, los anticuerpos anti-etiqueta His se diluyeron 1000 veces. Los anticuerpos para el control EF-Tu procedían de publicaciones anteriores34,35 y se diluyeron 20.000 veces.

Para realizar la separación de minicélulas, los cultivos de E. coli primero se centrifugaron a 1000 × g durante 40 minutos para precipitar células grandes. El sobrenadante se tomó y se centrifugó a 20.000 × g durante 10 min. La precipitación se lavó con tampón PBS una vez, luego se resuspendió hasta una DO600 de 10. Las células se mezclaron con oro fiducial BSA de 6 nm (Aurion) y luego, se depositaron 3 µl de la mezcla sobre una película de carbono continua recién descargada y recién descargada. rejillas (Quantifoil Cu R3.5/1 con película de carbono continua de 2 nm, malla 200). Usando Vitrobot Mark IV (FEI), las rejillas se secaron con papeles de filtro durante 4 segundos y se sumergieron en etano líquido. Las muestras se almacenaron en nitrógeno líquido.

Todas las series de inclinación se recopilaron utilizando un paso angular de 5°, de −50° a +50°, desenfoque de −1,5 a −5 µm y una dosis total de aproximadamente 100 e−/Å2. Para el GspDα en el conjunto de datos de la membrana interna y externa, se tomaron imágenes de la muestra usando el esquema de recolección de datos bidireccional (ángulo inicial -30°) en un microscopio FEI Titan Krios de 300 kV con una cámara detectora de electrones directa Gatan K2 Summit, usando el software SerialEM. . La ampliación fue de 81.000 ×, con un tamaño de píxel de 1,76 Å. Para los otros conjuntos de datos y el conjunto de datos de control, se tomaron imágenes de la muestra utilizando un esquema de recolección de datos con dosis simétrica en un microscopio FEI Glacios de 200 kV con una cámara detectora de electrones directa Falcon 4, utilizando el software de tomografía. El aumento fue de 92.000 ×, con un tamaño de píxel calibrado de 1,52 Å (Tabla complementaria 1).

Los fotogramas sin procesar fueron alineados por MotionCorr236. La alineación de la serie de inclinación, la reconstrucción del tomograma y la corrección del CTF se realizaron en EMAN226. Para el refinamiento, se seleccionaron manualmente 32,915 partículas de 250 series de inclinación y se extrajeron usando un tamaño de caja de 256. Después de generar un modelo inicial con un pequeño conjunto de partículas que tienen una buena relación señal-ruido, se realizaron 4 iteraciones de refinamiento del subtomograma. realizado. Se excluyó el peor 20% de las partículas en función de su similitud con la estructura promediada.

Debido a la forma de GspDα, su vista superior e inferior son difíciles de distinguir, y después del refinamiento, muchas partículas de la vista superior estaban alineadas incorrectamente en aproximadamente 180°. Para corregir esto, se desarrolló un algoritmo que decide un centro para cada tomograma en función de todas las partículas seleccionadas en este tomograma y dibuja un vector desde la posición de la partícula hasta el centro (o en la dirección opuesta si se activa el parámetro "invertir"). Si la orientación de una partícula del resultado del refinamiento no mira hacia el mismo lado que su vector correspondiente, su orientación girará 180°. Después de la corrección, se escribió un nuevo archivo de orientación de partículas y se utilizó como entrada para la siguiente iteración de refinamiento. En las siguientes iteraciones, se utilizó el refinamiento local para garantizar que la orientación de las partículas no gire hacia el lado equivocado. Y se realizaron tres iteraciones más de refinamiento para lograr la estructura final.

Para determinar la simetría de las partículas, primero erigimos cada partícula según su orientación desde el refinamiento y las proyectamos en imágenes 2D, y luego realizamos una clasificación 2D en EMAN2, pero el resultado no mostró clases claramente diferentes ni simetría explícita. También refinamos la simetría C12, C14 y C16, pero el mapa de densidad resultante no mostró diferencias obvias ni mejoras de características en comparación con la estructura C15. Para medir el radio de la partícula, aplicamos un filtro de paso bajo a la imagen de proyección 2D de la partícula, calculamos la intensidad radial media a lo largo del eje radial y luego registramos el índice correspondiente al valor de intensidad máxima (Figura complementaria 2). El radio de la partícula es el número de píxeles multiplicado por angstrom por píxel.

Para visualizar más claramente la región de conexión de la membrana de GspDα, hicimos una clasificación enfocada, usando una máscara que se enfoca en la región de conexión de la membrana del mapa de densidad (Figura complementaria 3, cuadro de línea discontinua). Dentro de los resultados, hay una clase que muestra características C1 (Figura complementaria 3, cuadro de línea roja). Para lograr esta estructura C1, hicimos una liberación de simetría utilizando todo el conjunto de datos: con la orientación del eje de simetría inalterada, se permite que cada partícula gire alrededor del eje de simetría y busque la unidad de simetría mejor ajustada para una iteración, seguida de Promediado de subtomogramas. Luego, las orientaciones de las partículas están sujetas a dos iteraciones de refinamiento estándar de oro, realizando solo una búsqueda local.

Hemos observado partículas insertadas inclinadas en las tomografías (Fig. 1e-g), lo que indica que, para estas partículas en el proceso de alineación, si damos un mapa de referencia donde la membrana y el eje de simetría de las partículas son perpendiculares, la densidad de la membrana y la densidad de proteínas no se pudo alinear correctamente al mismo tiempo. Si el plano de densidad de la membrana está correctamente alineado, la orientación de la densidad de las proteínas será inexacta. Para resolver este problema, hicimos un refinamiento enfocado. Se generó una máscara que encierra la parte no transmembrana de la proteína, excluyendo la densidad de la membrana, y se realizó una iteración de alineación utilizando la estructura enmascarada como referencia (Figura complementaria 3g). En esta iteración, la parte de densidad de proteínas debe estar alineada correctamente. Luego comparamos la orientación del refinamiento enfocado con la del refinamiento general, y la diferencia de orientación representa el ángulo de inclinación de la proteína. Se pudo trazar la diferencia de orientación para cada partícula y se calculó una trayectoria. Para mostrar el movimiento, la trayectoria completa se dividió en varios intervalos y se calcularon los promedios de clase para cada intervalo que representan la conformación correspondiente (Figura complementaria 3h).

El flujo de trabajo de procesamiento de datos para GspDα en el conjunto de datos de la membrana externa, el conjunto de datos complejo GspDβ-GspS y GspDβ en el conjunto de datos de la membrana interna se asemeja al GspDα en el conjunto de datos de la membrana interna, pero es más simple. Después de la corrección del movimiento y la reconstrucción de la tomografía, se recogieron partículas de las tomografías. Después de generar el modelo inicial, el refinamiento se realizó primero con simetría C15 durante 4 iteraciones y luego se corrigieron las orientaciones de las partículas utilizando la geometría de la membrana celular. Luego se realizaron otras 4 iteraciones de refinamiento local para lograr la estructura final (para los refinamientos de C5, solo cambiamos la entrada de simetría a C5 y los demás parámetros fueron los mismos). El protocolo de liberación de simetría de GspDα en el conjunto de datos de la membrana externa siguió al de GspDα en el conjunto de datos de la membrana interna.

Las proteínas de la membrana externa se extrajeron utilizando un kit de extracción de proteínas de membrana bacteriana (BestBio). Brevemente, se recogieron células de E. coli que expresaban la proteína de interés mediante centrifugación, se lavaron dos veces con PBS y se suspendieron en la solución de extracción A (que contiene una mezcla de inhibidor de proteasa). Después de 1 h de agitación a 4 °C, la suspensión se centrifugó a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C para eliminar el sedimento. El sobrenadante se tomó y se incubó a 37 °C durante 1 h, luego de lo cual se pudo observar que el líquido se dividió en dos capas. El líquido del fondo se recogió como proteínas de la membrana exterior.

La separación de las membranas interna y externa mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa isopícnica se realizó como se describió anteriormente37. Brevemente, se recogieron células de E. coli que expresaban la proteína de interés mediante centrifugación y se suspendieron en tampón A (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; sacarosa 0,5 M; lisozima 10 mg/ml; EDTA 1,5 mM). Después de la incubación en hielo durante 7 minutos, la suspensión se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 °C y luego el sedimento se resuspendió en tampón B (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; sacarosa 0,2 M; MgCl2 1 M). ) que contiene reactivo de nucleasa ARNasa/DNasa y cóctel inhibidor de proteasa. La mezcla se lisó mediante sonicación y se centrifugó a 6169 x g durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Posteriormente, el sobrenadante se sedimentó mediante ultracentrifugación a 184.500 x g durante 1 h a 4 °C y luego se suspendió en tampón C (Tris-HCl 1 mM, pH 7,5; EDTA 1 mM) que contenía 20% de sacarosa para obtener la fracción total de membrana. . Después de eso, se colocaron en capas el tampón C que contenía 73% de sacarosa y el tampón C que contenía 53% de sacarosa en un tubo de 13 ml (Beckman Coulter), comenzando desde abajo, y finalmente, se colocaron en capas 0,5 ml de la fracción de membrana total en la parte superior, seguido por tampón C que contiene 20% de sacarosa para llenar el tubo de 13 ml. Luego, los gradientes de densidad se centrifugaron a 288.000 × g durante 16 h a 4 °C, y la banda leonada en la interfaz entre las capas de sacarosa del 20% y el 53% y la banda blanca en la interfaz entre las capas de sacarosa del 53% y el 73% se centrifugaron a 288.000 × g durante 16 h a 4 °C. recogidos como fracción de membrana interna y fracción de membrana externa, respectivamente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas de densidad se depositan en EMDB con códigos de acceso: EMD-29702 (GspDα en la membrana interna), EMD-29703 (GspDα en la membrana externa), EMD-29698 (GspDβ en la membrana interna), EMD-29697 (GspDβ-GspS en la membrana externa, que expresa solo GspDβ), y EMD-29696 (GspDβ – GspS en la membrana externa, que expresa GspDβ y GspS). Los datos fuente se proporcionan en este documento.

Todos los códigos relevantes están disponibles en el paquete EMAN2.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40656-5

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Este trabajo fue apoyado por R01GM143380 y R01HL162842, la Welch Foundation Q-2173-20230405 y los fondos iniciales del departamento BCM BMB para ZW; la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82072312) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (Nº BK20211053) a XS; Programa de Innovación Práctica e Investigación de Postgrado de la Provincia de Jiangsu (Nº KYCX22_2925); y NIH R01GM080139 a SJL CryoEM los datos se recopilaron en el núcleo CryoEM ATC y UTHealth cryoEM de la Facultad de Medicina de Baylor, que incluye equipos adquiridos con el apoyo de CPRIT Core Facility Award RP190602. Agradecemos al Dr. Jun Liu y al Dr. Bo Hu por compartir el plásmido pBS58. Agradecemos a Hongjiang Wu por las discusiones sobre diseño de vectores y experimentos de bioquímica, a Valerie Dalton por revisar el lenguaje del artículo y a Snekalatha Raveendran por la copia de seguridad de los datos.

Mu Yuan Chen

Dirección actual: División de CryoEM y Bioimagen, SSRL, Laboratorio Nacional del Acelerador SLAC, Universidad de Stanford, Menlo Park, CA, 94025, EE. UU.

Estos autores contribuyeron igualmente: Zhili Yu, Yaoming Wu.

Verna y Marrs McLean Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Zhili Yu, Muyuan Chen, Tong Huo, Steven J. Ludtke y Zhao Wang

Laboratorio clave de anestesiología de la provincia de Jiangsu y laboratorio clave de aplicación de anestesia y analgesia de la provincia de Jiangsu, Universidad Médica de Xuzhou, Xuzhou, Jiangsu, 221004, China

Yaoming Wu, Wei Zheng y Xiaodong Shi

Núcleo de tomografía y microscopía electrónica criogénica, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Steven J. Ludtke y Zhao Wang

Departamento de Biología Molecular y Celular, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, EE. UU.

Zhao Wang

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Experimentos diseñados por ZW, XS y ZY. ZY realizó congelación de muestras e imágenes crio-ET. ZY, MC y TH procesaron datos crio-ET. YW y WZ realizaron experimentos de bioquímica. ZY escribió el artículo inicial. ZW, XS, SJL, YW y MC revisaron el artículo.

Correspondencia a Xiaodong Shi o Zhao Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Yu, Z., Wu, Y., Chen, M. et al. Proceso de translocación de membrana revelado por estructuras in situ de secretinas del sistema de secreción tipo II. Nat Comuna 14, 4025 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39583-2

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Recibido: 22 de febrero de 2023

Aceptado: 20 de junio de 2023

Publicado: 07 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39583-2

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