Alta barrera genética al SARS
Nature volumen 600, páginas 512–516 (2021)Cite este artículo
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El número y la variabilidad de los epítopos neutralizantes a los que se dirigen los anticuerpos policlonales en personas convalecientes del SARS-CoV-2 y vacunadas son determinantes clave de la amplitud de la neutralización y de la barrera genética para el escape viral1,2,3,4. Utilizando pseudotipos de VIH-1 y experimentos de selección de plasma con quimeras del virus de la estomatitis vesicular/SARS-CoV-25, aquí mostramos que los anticuerpos policlonales humanos atacan de manera variable múltiples epítopos neutralizantes, dentro y fuera del dominio de unión al receptor. Los objetivos de los anticuerpos coinciden con secuencias de picos enriquecidas para la diversidad en las poblaciones naturales de SARS-CoV-2. Al combinar sustituciones de picos seleccionadas en plasma, generamos pseudotipos de proteínas de pico 'polimutantes' sintéticas que resistieron la neutralización de anticuerpos policlonales en un grado similar a las variantes circulantes preocupantes. Al agregar variantes de sustituciones de picos seleccionadas por anticuerpos y asociadas a preocupaciones en una sola proteína de pico polimutante, demostramos que 20 mutaciones naturales en la proteína de pico del SARS-CoV-2 son suficientes para generar pseudotipos con resistencia casi completa a la neutralización policlonal. anticuerpos generados por personas convalecientes o receptores que recibieron una vacuna de ARNm. Sin embargo, el plasma de personas que habían sido infectadas y posteriormente recibieron la vacuna de ARNm neutralizó los pseudotipos que portaban este pico polimutante del SARS-CoV-2 altamente resistente o diversas proteínas de pico del sarbecovirus. Por lo tanto, los anticuerpos policlonales humanos obtenidos de manera óptima contra el SARS-CoV-2 deberían ser resistentes a futuras variaciones sustanciales del SARS-CoV-2 y pueden conferir protección contra posibles futuras pandemias de sarbecovirus.
Los anticuerpos neutralizantes provocados por una infección previa o por vacunación probablemente representen un componente clave de la inmunidad protectora contra el SARS-CoV-2. Se cree que los anticuerpos dirigidos al dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de pico dominan la actividad neutralizante del plasma de convalecientes o de receptores de vacunas6, e incluyen los anticuerpos neutralizantes más potentes clonados de individuos convalecientes7,8,9,10,11. Sin embargo, otros objetivos de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 incluyen el dominio N-terminal (NTD) y la maquinaria de fusión4,8,10,12,13, y se ha identificado el espectro completo de epítopos a los que se dirigen los anticuerpos neutralizantes en el plasma de convalecientes o de receptores de vacunas. no ha sido definido. Las variantes preocupantes (VOC) o variantes de interés (VOI) del SARS-CoV-2 codifican sustituciones de aminoácidos pico14,15,16,17, algunas de las cuales confieren resistencia a los anticuerpos monoclonales humanos individuales, pero tienen efectos variables, generalmente modestos, sobre la neutralización. por anticuerpos policlonales plasmáticos1,6,9,17,18,19,20. Los sitios mutados en los VOC incluyen aquellos en RBD, NTD y otros lugares, pero el número y la ubicación de las sustituciones de picos necesarias para que el SARS-CoV-2 evada los anticuerpos neutralizantes policlonales que se encuentran en los receptores de una vacuna o en las personas convalecientes se desconocen y son cruciales. Determinantes de la inmunidad de la población.
Aprovechando el hecho de que el plasma de convaleciente del SARS-CoV-2 neutraliza mal el SARS-CoV, comparamos la sensibilidad de los pseudotipos del VIH-1 que portan proteínas de pico quiméricas y parentales en las que se intercambiaron secuencias de RBD (SARS-CoV-2(1-RBD ) y SARS-CoV(2-RBD); Fig. 1a, Datos ampliados, Fig. 1) hasta la neutralización mediante plasma de 26 individuos de una cohorte de convalecientes de COVID-19 de la Universidad Rockefeller descrita previamente21. Las muestras de plasma se obtuvieron en promedio 1,3 meses después de la infección y se seleccionaron por sus altos títulos de neutralización del SARS-CoV-2 (el panel de plasma RU27). En comparación con el pseudotipo de SARS-CoV-2, el pseudotipo de SARS-CoV-2(1-RBD) fue menos sensible a la neutralización en 21 de los 26 plasmas (diferencia de mediana = 1,8 veces, rango de 0,5 a 9,8 veces, P = 0,0005 (prueba de Wilcoxon de dos colas); Fig. 1b). Por el contrario, el pseudotipo de SARS-CoV(2-RBD) fue más sensible que el pseudotipo de SARS-CoV a todos los plasmas (diferencia de medianas = 8 veces, rango de 1,2 a 75,5 veces, P <0,0001 (prueba de dos colas de Wilcoxon); Figura 1c). Sin embargo, la potencia neutralizante de algunos plasmas apenas se vio afectada cuando el RBD del SARS-CoV-2 fue reemplazado por el RBD del SARS-CoV, aunque algunos de esos plasmas eran mínimamente activos contra el SARS-CoV (por ejemplo, RU9, RU10, RU11 y RU15 (Fig. 1b, c). De hecho, los plasmas que neutralizaron mal el SARS-CoV neutralizaron potentemente los pseudotipos de picos quiméricos con RBD u otros dominios de picos del SARS-CoV-2 (Fig. 1b, c). Para el panel de plasma en su conjunto, la potencia neutralizante del pseudotipo contra el SARS-CoV-2 no se correlacionó con la potencia contra el SARS-CoV o el SARS-CoV-2 (1-RBD), pero sí se correlacionó con la potencia contra el SARS-CoV (2- RBD) (Datos ampliados, figuras 2a a c). Aunque la conformación alterada del RBD en las proteínas de pico quiméricas podría afectar la neutralización, estos datos indican que si bien el RBD constituye un objetivo neutralizador importante, una actividad neutralizante sustancial del plasma también está dirigida contra epítopos que no son RBD.
a, Diseño de proteínas de pico quiméricas intercambiadas con RBD. b, c, NT50 para 26 plasmas convalecientes de título alto (del panel RU1-27) contra viriones de VIH-1 pseudotipados que contienen las proteínas de pico indicadas. Se traza una mediana de dos experimentos independientes. FP, péptido de fusión; FC, repetición de heptada; TM, transmembrana.
Datos fuente
Para mapear con mayor precisión los objetivos de los anticuerpos neutralizantes policlonales en individuos convalecientes, pasamos un virus quimérico del virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV)/SARS-CoV-21,5 en presencia de cada uno de los plasmas RU27 durante hasta seis pases. . rVSV/SARS-CoV-2 imita las propiedades de neutralización del SARS-CoV-2 (refs. 1,5) pero obvia las preocupaciones de seguridad que acompañarían a dichos estudios con el SARS-CoV-2 auténtico. La secuenciación de próxima generación indicó que el paso de rVSV/SARS-CoV-2 en 22 de los 27 plasmas condujo a la selección de mutantes de pico (Fig. 2a, Datos ampliados, Fig. 3, Tabla complementaria 1). Para algunos plasmas, se seleccionaron múltiples sustituciones en sitios distintos pero proximales en subpoblaciones virales, lo que indica una actividad neutralizante dominante dirigida a un epítopo particular. Para otros plasmas, las sustituciones se enriquecieron en múltiples regiones de la secuencia codificante de picos, lo que sugiere actividades neutralizantes codominantes. Seis pases de rVSV/SARS-CoV-2 sin plasma enriquecieron una pequeña cantidad de sustituciones que se suponía representaban adaptaciones de cultivo celular o de mejora de la aptitud física (por ejemplo, T604I), pero que eran distintas de la mayoría de las sustituciones que surgieron después de rVSV/ Paso del SARS-CoV-2 en plasma (Datos ampliados, figura 3, tabla complementaria 1). En conjunto, las mutaciones seleccionadas en plasma se enriquecieron en elementos específicos dentro de NTD, RBD y otros dominios de pico (Fig. 2a, Tabla complementaria 1). De las 27 poblaciones de virus pasadas por plasma, se aislaron 38 virus mutantes individuales mediante purificación en placa; cada uno codificó una, dos o tres sustituciones de picos (Fig. 2b) que generalmente ocurrieron con alta frecuencia en las poblaciones virales pasadas (Tabla complementaria 1).
a, Frecuencias de sustituciones de aminoácidos en cada codón de la proteína de pico del SARS-CoV-2 en dos poblaciones independientes de rVSV/SARS-CoV-2 (1D7 y 2E1), determinadas mediante secuenciación de Illumina. Se muestran los resultados agrupados tras la selección con el panel de plasma RU27. b, Ubicaciones de sustituciones de aminoácidos en 38 aislados de rVSV/SARS-CoV-2 purificados en placa obtenidos de poblaciones de rVSV/SARS-CoV-2 después del paso en plasmas RU27. c, Frecuencias de sustituciones de aminoácidos naturales (círculos rojos) en cada codón de la proteína de pico del SARS-CoV-2. Las barras grises sombreadas en a-c indican regiones compartidas donde se enriquece la variación. d, Comparación de la frecuencia promedio de sustituciones observadas después del paso de rVSV/SARS-CoV-2 con plasmas RU27 (centro) y la frecuencia de cambios de secuencia en poblaciones naturales (derecha), proyectadas en la estructura de picos del SARS-CoV-2 (PDB 6VXX) con las posiciones del RBD y NTD indicadas (izquierda). La frecuencia promedio de sustituciones en un radio de 15 Å se representa mediante el espectro de colores (escala = 0–20 (centro) y 0–9 (derecha)). e, Potencia de neutralización de plasmas RU27 contra rVSV/SARS-CoV-2 que codifica mutantes de tipo salvaje (WT), seleccionados individualmente o proteínas de pico PMS1-1. Se traza una mediana de dos determinaciones independientes.
Datos fuente
Comparamos la distribución de mutaciones seleccionadas por el paso de rVSV/SARS-CoV-2 con el panel de plasma RU27 con las que ocurren en poblaciones circulantes de SARS-CoV-2 (Fig. 2a-d). Tanto en las secuencias seleccionadas en plasma como en las naturales, las sustituciones se enriquecieron en varios elementos que contribuyen al "supersitio" al que se dirigen los anticuerpos neutralizantes de unión a NTD12,13 (Fig. 2a-d). También fue evidente una variación similar de la secuencia natural y seleccionada en plasma en los elementos a los que se dirigen los anticuerpos neutralizantes de unión a RBD de clase 2 y 322. Las mutaciones que se sabe que confieren resistencia a los anticuerpos RBD de clase I no se seleccionaron mediante paso de plasma, lo que tal vez refleje una abundancia menor de la esperada de anticuerpos de clase I en este panel de plasma (Fig. 2a-d). Otros sitios, incluidos los aminoácidos de pico aproximadamente 680–700 y aproximadamente 930, mostraron variación en los conjuntos de datos de variantes naturales y de plasma, pero aún no se ha demostrado que sean el objetivo de los anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, la similitud en la distribución de la variación de secuencia natural y seleccionada en plasma dentro de la proteína de pico sugiere que la selección mediante anticuerpos neutralizantes es un factor de divergencia en las poblaciones circulantes de SARS-CoV-2.
De los 38 mutantes de rVSV/SARS-CoV-2 purificados en placa recuperados después del paso en plasmas RU27, 34 exhibieron diversos grados de sensibilidad reducida a la neutralización por el plasma que se usó para su selección (mediana del título de neutralización medio máximo reducido 3,1 veces). (NT50), rango de 0,8 a 39,3 veces; datos ampliados, figuras 4, 5). Sin embargo, para 37 de los 38 mutantes seleccionados de rVSV/SARS-CoV-2, el plasma seleccionado exhibió actividad neutralizante residual. Agregamos 13 mutaciones de los virus seleccionados en plasma en función de sus efectos sobre la sensibilidad de neutralización del plasma (Datos ampliados, figuras 4, 5) y la distribución en toda la proteína de pico, generando una única secuencia de proteína de pico 'polimutante' sintética (PMS), denominada PMS1. -1 (Datos ampliados, figura 6a). Un derivado de rVSV/SARS-CoV-2 que codifica estas mutaciones de pico (rVSV/SARS-CoV-2PMS1-1) exhibió una resistencia a la neutralización por el panel de plasma RU27 que fue mayor en magnitud y consistencia que los mutantes individuales seleccionados en plasma (mediana 8,0 -veces, rango de 2,7 a 52,9 veces; Fig. 2e). Sin embargo, 26 de los 27 plasmas RU27 conservaron actividad neutralizante residual contra rVSV/SARS-CoV-2PMS1-1 (Fig. 2e, Datos ampliados, Fig. 6b). Concluimos que algunos epítopos neutralizantes se comparten entre los anticuerpos convalecientes en plasmas de alto título, pero la actividad neutralizante contra el SARS-CoV-2 es claramente policlonal y heterogénea entre los individuos con respecto a los objetivos de los epítopos.
Generamos un panel de pseudotipos de VIH-1 que llevan la proteína de pico PMS1-1, una segunda proteína PMS con un conjunto diferente de 13 mutaciones (seleccionadas según criterios similares; conocida como PMSD4), o variantes naturales o parientes del SARS-1. Proteína de pico CoV-2 (Datos ampliados, Fig. 7a, b). El panel incluyó varias proteínas de pico VOC o VOI del SARS-CoV-2, y proteínas de pico de sarbecovirus encontrados en murciélagos (bCoV-RaTG13), pangolines (pCoV-GD y pCoV-GX) y anteriormente en humanos (SARS-CoV), que exhiben diversos grados de divergencia de secuencia con respecto al SARS-CoV-2 (refs. 23,24,25) (consulte Datos ampliados, figura 1 para la caracterización del pseudotipo). Para determinar la sensibilidad y resistencia a los anticuerpos policlonales contra el SARS-CoV-2, utilizamos un conjunto independiente de 21 plasmas de convalecientes seleccionados al azar (Ran1-21) y un conjunto de 14 plasmas de receptores que recibieron una vacuna de ARNm (Vac1-14). además del panel de plasma de alto título RU27. Las proteínas de pico del síndrome premenstrual exhibieron un grado de resistencia a la neutralización que disminuyó con el rango exhibido por los cuatro VOC/VOI del SARS-CoV-2 y los otros cuatro sarbecovirus (datos ampliados, figuras 8a-c, 9a-c). Específicamente, PMS1-1 y PMSD4 exhibieron una resistencia a la neutralización mayor que B.1.1.7 VOC y B.1.526 VOI, similar a P.1 VOC y menor que B.1.351.3 VOC. PMS1-1 y PMSD4 fueron más resistentes a la neutralización que pCoV-GD y bCoV-RaTG13, los cuales contienen una mayor cantidad de cambios en relación con el SARS-CoV-2 que las proteínas de pico del PMS. Por el contrario, los pseudotipos pCoV-GX y SARS-CoV fueron más resistentes al plasma de convalecientes o receptores de vacunas del SARS-CoV-2 que PMS1-1 y PMSD4 (datos ampliados, figuras 8a-c, 9a-c). En particular, al igual que PMS1-1 y PMSD4, el VOC B.1.351.3 que codifica solo nueve mutaciones de pico en relación con el SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1 fue más resistente a la neutralización que los sarbecovirus (pCoV-GD y bCoV-RaTG13). que contienen un mayor número de sustituciones, lo que sugiere que las mutaciones B.1.351.3 fueron seleccionadas por presión de anticuerpos.
Sobre la base de los hallazgos anteriores, intentamos generar una proteína de pico mutante del SARS-CoV-2 que fuera mínimamente divergente del SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1, pero resistente a la neutralización por plasma policlonal de convalecientes y receptores de vacunas. La derivación exitosa de dicha proteína de pico identificaría una lista completa de epítopos de neutralización reconocidos por los anticuerpos policlonales. Elegimos 20 mutaciones naturales, incluidos 8 cambios NTD y 8 RBD (Fig. 3a) que (1) surgieron en nuestros experimentos de selección de plasma (Fig. 2b), (2) ocurren en COV con sensibilidad de neutralización reducida (Figuras de datos extendidos). . 7, 8) o (3) surgieron en nuestros estudios previos en los que se seleccionó la resistencia a los anticuerpos monoclonales humanos1,2,9. Se incluyeron mutaciones por deleción que ocurren naturalmente en el NTD (Datos ampliados, figura 7b), así como múltiples sustituciones que confieren resistencia a los anticuerpos de unión a RBD de clases 1, 2 y 31,2,9. Un derivado de rVSV/SARS-CoV-2 que codifica la secuencia de picos resultante, denominado PMS20 (Fig. 3a), fue replicable competente pero atenuado en comparación con rVSV/SARS-CoV-22E1, lo que sugiere que las 20 mutaciones confieren un costo de aptitud (Fig. 3b). Sin embargo, los pseudotipos de VIH-1 que portaban PMS20 eran igualmente infecciosos que aquellos que portaban la proteína de pico parental (Datos ampliados, figura 1) y eran altamente resistentes a la neutralización. De hecho, 17 de los 21 plasmas de convalecientes aleatorios y 8 de los 14 plasmas de receptores de vacunas de ARNm produjeron una neutralización indetectable de los pseudotipos de PMS20 (menos de 1:50; Fig. 3c). Entre los plasmas RU27 convalecientes de título alto, 23 de 27 tenían actividad neutralizante residual contra PMS20 que se redujo en una mediana de 32 veces en comparación con el pseudotipo parental (rango de 2,8 a 114 veces; Datos ampliados, figura 9a). Concluimos que las 20 mutaciones en la proteína de pico PMS20 son suficientes para evadir la mayoría de los anticuerpos en el plasma de personas que han sido infectadas o vacunadas contra el SARS-CoV-2.
a, Diseño de la proteína de pico PMS20 con 20 mutaciones seleccionadas por anticuerpos y asociadas a COV. b, Replicación de quimeras rVSV/SARS-CoV-2 que codifican proteínas de pico 2E1 (parentales) o PMS20 en células 293T/ACE2cl.22 infectadas con una multiplicidad de 0,001 y 0,008, respectivamente. c, Potencia de neutralización comparativa de plasmas de convalecientes (Ran1–21; izquierda) y receptores de vacunas (Vac1–14; derecha) seleccionados al azar, contra los pseudotipos Wuhan-hu-1 y PMS20 (b) SARS-CoV-2 VIH-1. Para b y c, se traza la mediana ± rango de dos determinaciones independientes.
Datos fuente
A diferencia de los plasmas de personas que habían sido infectadas o vacunadas, un panel de plasmas de 14 personas, denominados "infectados y luego vacunados" (ITV), que habían sido infectados por el SARS-CoV-2 y posteriormente recibieron vacunas de ARNm3 conservaron actividad neutralizante contra los pseudotipos de VIH-1 que llevan el pico PMS20 (Fig. 4a, b). De hecho, las mutaciones de PMS20 que redujeron los valores de NT50 en plasma de Ran21 y Vac14 en una mediana de 50 veces (rango de 5,9 a 225 veces) y 81 veces (rango de 8,4 a 229 veces), respectivamente, causaron una reducción mediana de NT50 de solo 18,6 veces (rango de 3,9 a 100 veces) para el panel de plasma ITV (Fig. 4a, b). El análisis de las proteínas de pico quiméricas SARS-CoV-2/PMS20 en las que se intercambiaron los respectivos RBD (PMS20(2-RBD) y SARS-CoV-2(PMS-RBD)) indicó que la resistencia relativa de la proteína de pico PMS20 a ambos Los plasmas de Ran e ITV fueron conferidos por múltiples determinantes de picos y la amplitud de neutralización en los plasmas de ITV se debió a anticuerpos dirigidos a determinantes tanto RBD como no RBD (Fig. 4a). Además de la potente actividad neutralizante previamente informada de los plasmas de ITV contra los COV B.1.1.7, B.1.525, P.1 y B.1.351.33, los plasmas de ITV también neutralizaron potentemente B.1.617.2 (delta), así como una variante recientemente descrita (A.VOI.V2)26 que tiene 11 sustituciones y 3 eliminaciones en la proteína de pico, incluido un NTD ampliamente mutado, y se predice que será resistente a la neutralización de unión a RBD de clase 2 y 3. anticuerpos (Datos ampliados, Fig. 10a).
a, Potencia de neutralización comparativa (valores NT50) de plasmas convalecientes aleatorios (Ran1–21; izquierda) e ITV (ITV1–14; derecha) contra pseudotipos de VIH-1 que portan proteínas de pico quiméricas intercambiadas con SARS-CoV-2, PMS20 y RBD. b, Diferencia de veces en NT50, comparando la neutralización de pseudotipos de VIH-1 que portan proteínas de pico de SARS-CoV-2 y PMS20 mediante plasmas Ran1–21, Vac1–15 e ITV1–14 (los valores de P se calcularon utilizando un método de Mann de dos caras). Prueba de Whitney; las líneas horizontales indican los valores medianos). c, Curvas de neutralización para plasmas de ITV y los pseudotipos de sarbecovirus VIH-1 indicados. Para a y c, se traza la mediana ± rango de dos determinaciones independientes.
Datos fuente
El plasma de los individuos que son ITV también tuvo una actividad neutralizante sustancial contra los pseudotipos heterólogos del VIH-1 del sarbecovirus, incluidos aquellos que fueron pobremente neutralizados por los paneles de plasma Ran21, Vac14 y RU27 y cuyas secuencias RBD y/o NTD son muy divergentes de las del SARS-CoV- 2 (Fig. 4c, Datos ampliados Fig. 10a, b). Los valores medios de NT50 para los plasmas de ITV contra pseudotipos de sarbecovirus fueron 5.330 (rango 2.369–7.222) para bCoV-RaTG13, 3.617 (rango 1.780–6.968) para pCoV-GX, 2.605 (rango 1.386–3.181) para bCoV-WIV16 y 1.208 ( rango 621–2705) para SARS-CoV (Fig. 4c, Datos ampliados, Fig. 10a). En particular, la actividad neutralizante de los plasmas de ITV contra los sarbecovirus divergentes bCoV-WIV16 y SARS-CoV fue similar a la encontrada en los plasmas de convalecientes aleatorios contra el SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1. Por lo tanto, la potencia de neutralización y la amplitud del plasma policlonal después de la vacunación con ARNm de personas que habían sido previamente infectadas con SARS-CoV-2 parecen mayores de lo que se pensaba anteriormente.
Estos resultados indican la presencia de abundantes dianas de anticuerpos neutralizantes en la proteína de pico del SARS-CoV-2. Nuestros análisis recientes sugieren además que la maduración de la afinidad, durante meses de convalecencia, confiere flexibilidad y afinidad a los anticuerpos2,3,27 y puede imponer el requisito de múltiples sustituciones virales para escapar de los anticuerpos neutralizantes individuales. Por tanto, algunos anticuerpos monoclonales humanos tienen una actividad sustancial contra las variantes del SARS-CoV-2 y los sarbecovirus divergentes2,28. En general, la diversidad, madurez y alta concentración de anticuerpos neutralizantes probablemente explican por qué el plasma policlonal de individuos que han sido infectados y posteriormente vacunados podría neutralizar eficazmente el polimutante PMS20, que de otro modo sería altamente resistente a la neutralización, así como los sarbecovirus que son divergentes del SARS-CoV. -2. Si bien los regímenes de vacunas estándar de ARNm pueden ser menos efectivos que la infección para provocar la amplitud de anticuerpos individuales29, queda por ver si la potencia y la amplitud de la neutralización policlonal se pueden lograr mediante un refuerzo en el momento adecuado con las vacunas contra el SARS-CoV-2 existentes. De ser así, los inmunógenos existentes pueden proporcionar una protección sólida contra futuras variantes del SARS-CoV-2 y un grado de protección contra diversas amenazas potenciales futuras de sarbecovirus. Por el contrario, las proteínas PMS que codifican numerosas mutaciones de escape de la neutralización pueden representar inmunógenos útiles para ampliar la respuesta de anticuerpos policlonales provocada por las vacunas de primera generación contra el SARS-CoV-2.
Las células 293T (American Type Culture Collection (ATCC) CRL-11268), 293T/ACE2cl.22 y HT1080/ACE2.cl.145 se derivaron de existencias originales compradas en la ATCC y se supuso que estaban autenticadas por la ATCC. Las células se comprobaron periódicamente para detectar contaminación por micoplasmas y retrovirus mediante tinción DAPI y ensayos de transcriptasa inversa, respectivamente.
Los plásmidos pSARS-CoV-2-SΔ19 y pSARS-CoV-SΔ19 que expresan el SARS-CoV-2 truncado en el extremo C (NC_045512) y las proteínas de pico del SARS-CoV se describieron previamente5 y se utilizaron para construir el SARS-CoV-2(1). -RBD) y plásmidos de expresión del SARS-CoV(2-RBD) en los que se intercambiaron recíprocamente secuencias codificantes de RBD. Se construyó un panel de plásmidos que expresan proteínas de pico de SARS-CoV-2 VOC y VOI en el contexto de pSARS-CoV-2-SΔ19 (R683G)5. Las sustituciones se introdujeron utilizando fragmentos de genes sintéticos (IDT) o mutagénesis mediada por PCR de extensión superpuesta y ensamblaje de Gibson. Todos los COV/VOI y las proteínas de pico polimutantes también incluyeron la sustitución R683G, que altera el sitio de escisión de furina y genera reservas de virus con títulos más altos sin efectos significativos sobre la sensibilidad de neutralización del virus pseudotipado (Datos ampliados, Fig. 1c, d). Las potencias con las que el plasma neutralizó a los miembros del panel de pseudotipo mutante se compararon con las potencias contra una secuencia de picos de SARS-CoV-2 "de tipo salvaje", que llevaba R683G cuando correspondía. Plásmidos que expresan las proteínas de pico que se encuentran en el coronavirus bCoV-RaTG13 del murciélago de herradura (Rinolophus affinis) (ref. 23), así como en los coronavirus de pangolín (Manis javanica) de Guangdong, China (pCoV-GD) y Guanxi, China (pCoV-GX). )24,25 fueron construidos de manera similar. Las secuencias de picos se modificaron con codones para maximizar la homología con el uso de codones humanos optimizado del plásmido VG40589-UT (sinobiológico) que expresa pSARS-CoV-2. La secuencia codificante truncada (CDS) de 19 aminoácidos de bCoV-RaTG13 (QHR63300), pCoV-GD (CoV_EPI_ISL_410721) y pCoV-GX (CoV_EPI_ISL_410542) fue sintetizada por GeneART y subclonada en pCR3.1 usando NheI y XbaI y ensamblaje de Gibson. y denominados pCR3.1-bCoV-RaTG13-SΔ19, pCR3.1pCoV-GD-SΔ19 y pCR3.1-pCoV-GX-SΔ19, respectivamente. Se generaron partículas pseudotipadas de VIH-1 como se describió anteriormente5. Específicamente, las reservas de virus se recolectaron 48 h después de la transfección de células 293T con pHIV-1 GagPol y pCCNano/LucGFP (Fig.1) o pNL4-3ΔEnv-nanoluc (todas las demás figuras) junto con un plásmido de expresión de pico, se filtraron y almacenaron en - 80 ºC.
Los plasmas se diluyeron en serie cinco veces y luego se incubaron con virus indicador VIH-1 pseudotipado durante 1 hora a 37 °C. Luego se añadió la mezcla de anticuerpo y virus pseudotipo a las células HT1080/ACE2.cl14. Después de 48 h, las células se lavaron con PBS, se lisaron con reactivo de lisis de cultivo celular luciferasa (Promega) y se midió la actividad de luciferasa Nanoluc en lisados usando el sistema de ensayo Nano-Glo Luciferase (Promega) y un luminómetro Glomax Navigator (Promega). Las unidades de luminiscencia relativas se normalizaron con respecto a las derivadas de células infectadas con el virus pseudotipado en ausencia de plasma. La NT50 se determinó mediante regresión no lineal de cuatro parámetros (método de regresión de mínimos cuadrados sin ponderación) (GraphPad Prism).
Las muestras de plasma procedían de personas que estuvieron infectadas con SARS-CoV-2 durante una media de 1,3 meses antes de la donación de plasma7 o de personas que habían recibido vacunas de ARNm en varios momentos antes de la donación de plasma9. En los procedimientos de selección de VSV-SARS-CoV-2 se utilizó un conjunto de 27 muestras de plasma de individuos infectados con SARS-CoV-2 con alta actividad neutralizante que no habían sido vacunados7, denominado panel de plasma 'RU27', mientras que este panel más un segundo conjunto de 21 plasmas seleccionados al azar (seleccionados al azar con enmascaramiento del título de neutralización o cualquier característica demográfica) de la misma cohorte de convalecientes formó el panel de plasma 'Ran21'7. Un conjunto de 14 plasmas donados por personas que habían recibido una vacuna de ARNm de Pfizer/BioNTech formaron el panel de plasma 'Vac14'9. Finalmente, un conjunto de 15 plasmas de personas convalecientes que habían recibido una vacuna de ARNm de Pfizer/BioNTech entre 6 y 12 meses después de la infección3 formaron el panel de plasma 'ITV15' infectado y luego vacunado. Las visitas del estudio y las extracciones de sangre se obtuvieron con el consentimiento informado de todos los participantes según un protocolo que fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Rockefeller (IRB no. DRO-1006, 'Sangre periférica de supervivientes de coronavirus para identificar virus neutralizantes). Anticuerpos').
Para seleccionar variantes de pico resistentes al plasma, se pasaron rVSV/SARS-CoV-2/GFP1D7 y rVSV/SARS-CoV-2/GFP2E1 para generar diversidad, y se incubaron poblaciones que contenían 106 unidades formadoras de placas con plasma (diluido 1:50). –1:400) durante 1 h a 37 °C antes de la inoculación de 2 × 105 células 293T/ACE2cl.22 en placas de seis pocillos. Al día siguiente, el medio se reemplazó con medio nuevo que contenía las mismas concentraciones de plasma. 24 h después se recogió el sobrenadante de los pocillos que contenían las concentraciones más altas de anticuerpos plasmáticos que mostraron evidencia de replicación de rVSV/SARS-CoV-2/GFP (grandes cantidades de células positivas para GFP o focos positivos para GFP). A partir de entonces, se incubaron alícuotas (100 µl) del sobrenadante eliminado del primer pase (p1) con la misma o mayor concentración de plasma y luego se usaron para infectar 2 × 105 células 293T/ACE2cl.22 en placas de seis pocillos, como antes. (p2). En situaciones en las que se observaron focos positivos para GFP pequeños pero en expansión, el medio se actualizó a las 48 h con medio fresco que no contenía plasma y el virus se recogió 24 h después. Repetimos este proceso hasta por seis pases o hasta que la potencia de neutralización reducida del plasma fue obvia, como lo indica la detección visual de un número creciente de células positivas para GFP durante el pase.
Para aislar virus mutantes individuales mediante dilución limitante, las poblaciones seleccionadas de rVSV/SARS-CoV-2/GFP1D7 y rVSV/SARS-CoV-2/GFP2E1 se diluyeron en serie en ausencia de plasma y se agregaron alícuotas de cada dilución a pocillos individuales de 96 -placas de pocillos que contienen 1 × 104 células 293T/ACE2cl.22. Las variantes virales individuales se identificaron mediante la observación de placas únicas positivas para GFP en pocillos individuales en diluciones limitantes. Los virus purificados en placa se expandieron, se extrajo el ARN y se determinaron las secuencias de picos.
Las muestras de plasma se diluyeron en serie cinco veces y luego se incubaron con rVSV/SARS-CoV-2/GFP1D7 y rVSV/SARS-CoV-2/GFP2E1, o variantes seleccionadas de los mismos purificadas en placa, durante 1 hora a 37 °C. Luego se añadió la mezcla de anticuerpos y virus recombinante a las células 293T/ACE2.cl22. Después de 16 h, se recogieron las células y las células infectadas se cuantificaron mediante citometría de flujo. El porcentaje de células infectadas se normalizó con respecto al derivado de células infectadas con rVSV/SARS-CoV-2 en ausencia de plasma. El NT50 para cada plasma se determinó mediante regresión no lineal de cuatro parámetros (método de regresión de mínimos cuadrados sin ponderación) (GraphPad Prism).
Para identificar supuestas mutaciones de resistencia a los anticuerpos, se aisló ARN de alícuotas de sobrenadante que contenían poblaciones virales seleccionadas o variantes individuales purificadas en placa utilizando el kit NucleoSpin 96 Virus Core (Macherey-Nagel). El ARN purificado se sometió a transcripción inversa utilizando cebadores hexámeros aleatorios y el kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Thermo Fisher Scientific). El ADNc se amplificó utilizando ADN polimerasa KOD Xtreme Hot Start (Millipore Sigma). Específicamente, se amplificó un fragmento que incluía la región codificante del dominio extracelular de la proteína de pico usando cebadores dirigidos a la región intergénica entre VSV-M y el pico, y el dominio intracelular de pico. Los productos de la PCR se purificaron y secuenciaron utilizando la secuenciación de Sanger o la secuenciación de Illumina como se describió anteriormente30. Para la secuenciación de Illumina, se utilizó 1 µl de ADN diluido con 0,25 µl de la enzima Nextera TDE1 Tagment DNA (15027865, Illumina) y 1,25 µl de tampón TD Tagment DNA (15027866, Illumina). Luego, el ADN se ligó a cebadores con código de barras i5/i7 utilizando el kit Illumina Nextera XT Index v2 y KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X; KAPA Biosystems). A continuación, el ADN se purificó utilizando AmPure Beads XP (Agencourt), se combinó y se secuenció (extremo emparejado) utilizando los kits de ciclo Illumina MiSeq Nano 300 V2 (Illumina) a una concentración de 12 pM.
Para el análisis de los datos de secuenciación de Illumina, las secuencias del adaptador se eliminaron de las lecturas sin procesar y de las lecturas de baja calidad (puntuación de calidad Phred inferior a 20) utilizando BBDuk. Las lecturas filtradas se asignaron a la secuencia S del SARS-CoV-2 con codones optimizados en rVSV/SARS-CoV-2/GFP y las mutaciones se anotaron utilizando Geneious Prime (versión 2020.1.2), utilizando un valor de corte de P de 10- 6. Las frecuencias variantes específicas de RBD, los valores P y la profundidad de lectura se compilaron utilizando Python ejecutando pandas (1.0.5), numpy (1.18.5) y matplotlib (3.2.2). Las secuencias parentales de rVSV/SARS-CoV-2/GFP 2E1 y 1D7 contienen cada una dos mutaciones adaptativas (F157S y R685M para 1D7; D215G y R683G para 2E1), pero cada una se consideró "de tipo salvaje" a los efectos de los experimentos de selección de plasma. y fueron restados de los análisis de las secuencias.
La frecuencia de las sustituciones de aminoácidos durante el paso de rVSV/SARS-CoV-2 en plasmas se comparó con la frecuencia de ocurrencias globales de cambios en cada residuo el 11 de mayo de 2021 (Los Alamos, COVID-19 Viral Genome Analysis Pipeline; https:// cov.lanl.gov/content/index)31. Para comparar el SARS-CoV-2 con los sarbecovirus, las secuencias de aminoácidos se alinearon con Clustal Omega. Utilizando un clon de Simplot en Python (https://jonathanrd.com/20-05-02-writing-a-simplot-clone-in-python/), se calculó el porcentaje de identidad relativo al SARS-CoV-2 dentro de un ventana móvil de 100 aminoácidos, avanzando un solo residuo a la vez.
Para el análisis de ventana deslizante tridimensional de los cambios en la secuencia de aminoácidos de la espiga observados globalmente e in vitro, la frecuencia de ocurrencias globales de cambios en cada residuo (Los Alamos, COVID-19 Viral Genome Analysis Pipeline, https://cov.lanl .gov/content/index)31 se dividió por la frecuencia promedio de cambio en cualquier residencia y se proyectó en la estructura de picos del SARS-CoV-2 PDB 6VXX32 como frecuencia de cambio relativa utilizando BioStructMap33,34. Alternativamente, la frecuencia promedio de sustituciones observadas después de pasar rVSV/SARS-CoV-2 con plasma se dividió por la frecuencia de sustitución media y se aplicó como una ventana deslizante tridimensional sobre la estructura de la espiga. La frecuencia promedio de sustituciones en un radio de 15 Å se representa mediante un espectro de colores.
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este documento.
Los datos sobre las mutaciones seleccionadas en plasma se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Los conjuntos de datos del ensayo de neutralización generados durante el estudio actual están disponibles en los archivos de datos fuente complementarios adjuntos. Los datos originales se proporcionan con este documento.
Los análisis utilizaron software disponible comercialmente. No se generó ningún código nuevo.
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R37AI64003 y R01AI501111 de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (para PDB); R01AI78788 (a TH); y P01-AI138398-S1 y 2U19AI111825 (a MCN). DP fue apoyado por una subvención del Programa de Capacitación de Científicos Médicos del NIGMS (T32GM007739) al Programa Tri-Institucional MD-PhD Weill Cornell/Rockefeller/Sloan Kettering y por el NIAID (F30AI157898). CG recibió el apoyo de la beca posdoctoral Robert S. Wennett, en parte del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (programa de premios de ciencias clínicas y traslacionales de los Institutos Nacionales de Salud, subvención UL1 TR001866) y del Fondo Shapiro-Silverberg para el Avance de la investigación traslacional. PDB y MCN son investigadores del Instituto Médico Howard Hughes.
Estos autores contribuyeron igualmente: Fabian Schmidt, Yiska Weisblum
Laboratorio de Retrovirología, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.
Fabian Schmidt, Yiska Weisblum, Daniel Poston, Justin DaSilva, Fengwen Zhang, Eva Bednarski, Theodora Hatziioannou y Paul D. Bieniasz
Instituto Médico Howard Hughes, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.
Magdalena Rutkowska, Michel C. Nussenzweig y Paul D. Bieniasz
Laboratorio de Inmunología Molecular, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.
Alice Cho, Dennis J. Schaefer-Babajew, Christian Gaebler, Marina Caskey y Michel C. Nussenzweig
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PDB, TH, MCN, FS. y YW concibió, diseñó y analizó los experimentos. FS y YW construyeron y realizaron los experimentos de selección y neutralización de rVSV/SARS-CoV-2. FS, YW, MR, JDS y EB realizaron los experimentos de neutralización de pseudotipo. FS, TH y FZ construyeron los plásmidos de expresión. AC realizó una secuenciación de próxima generación. DP y FS realizaron análisis bioinformáticos. MC, CG y DJS-B. ejecutó los protocolos clínicos, reclutó participantes y procesó muestras. PDB, TH, FS y YW escribieron el manuscrito con aportaciones de todos los coautores.
Correspondencia a Theodora Hatziioannou o Paul D. Bieniasz.
PDB ha recibido una remuneración de Pfizer, Inc. por asesorar sobre vacunas de ARNm.
Información de revisión por pares Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.
Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.
a, Titulación de virus pseudotipados en células 293T/ACE2cl.22. Los virus pseudotipados de picos quiméricos en el panel superior izquierdo se construyeron utilizando las construcciones de proteínas de pico SARS-CoV-2Δ19 y SARS-CoVΔ19 inalteradas y un sistema de pseudotipado de VIH-1 de 3 plásmidos (ver Métodos). Los otros paneles representan la titulación de pseudotipos derivados utilizando una proteína de pico mutante del sitio de escisión de furina SARS-CoV-2Δ19 (R683G) y un sistema de pseudotipado de VIH-1 de 2 plásmidos (ver Métodos). b, Los mismos virus pseudotipados utilizados en (a) se utilizaron para infectar 3 líneas celulares clonales 293T/ACE2 diferentes, cada una de las cuales expresaba un nivel diferente de ACE2 (MFI = intensidad media de fluorescencia). c, Titulación de pseudotipos que contienen una proteína de pico de SARS-CoV-2Δ19 inalterada y una proteína de pico de SARS-CoV-2Δ19 mutante en el sitio de escisión de furina (R683G) generada utilizando un sistema de pseudotipo de VIH-1 de 2 plásmidos (ver Métodos). d, Potencia de neutralización comparativa (valores NT50) de plasmas de convalecientes de alto título (RU27) contra pseudotipos de VIH-1 que portan proteínas de pico de SARS-CoV-2Δ19 mutante R683G (símbolos grises) y inalteradas (símbolos rojos). Para todos los paneles, se traza la mediana ± rango de dos experimentos independientes.
Datos fuente
a – c, Correlaciones de las potencias neutralizantes de los plasmas RU27 contra los psudotipos que llevan los pares indicados de proteínas de pico. Se utilizó una regresión lineal simple para calcular los valores R2 y p; las líneas discontinuas indican intervalos de confianza del 95% para la línea de regresión.
Frecuencias de sustituciones de aminoácidos en cada codón de la proteína de pico del SARS-CoV-2 siguiendo el número indicado de pases (P2-P6) de dos poblaciones independientes de rVSV-SARS-CoV-2 (1D7 y 2E1), en cada una de las RU27 plasmas, determinados mediante secuenciación NGS.
Infección, en relación con controles no neutralizados, por aislados de rVSV/SARS-CoV-2 purificados en placa en presencia de las diluciones indicadas de los plasmas indicados del panel RU27. Los mismos plasmas que se usaron para seleccionar los mutantes indicados se usaron para determinar la potencia de neutralización contra los respectivos virus mutantes purificados en placa (rojo) y parentales (WT, gris) rVSV/SARS-CoV-2 1D7 o 2E1. Se traza la mediana ± rango de dos réplicas técnicas.
Infección, en relación con controles no neutralizados, por aislados de rVSV/SARS-CoV-2 purificados en placa en presencia de las diluciones indicadas de los plasmas indicados del panel RU27. Los mismos plasmas que se usaron para seleccionar los mutantes indicados se usaron para determinar la potencia de neutralización contra los respectivos virus mutantes purificados en placa (rojo) y parentales (WT, gris) rVSV/SARS-CoV-2 1D7 o 2E1. Se traza la mediana ± rango de dos réplicas técnicas.
a, Diseño de la proteína de pico polimutante PMS1-1 con 13 mutaciones de pico seleccionadas en plasma agregadas en un solo pico. b, Infección, en relación con controles no neutralizados, por rVSV/SARS-CoV2PMS1-1 (rojo) y rVSV/SARS-CoV22E1 (gris) en presencia de las diluciones indicadas de los plasmas del panel RU27. Se traza la mediana ± rango de dos réplicas técnicas.
a, Diseño de las proteínas de pico polimutantes PMS1-1 y PMSD4 con 13 mutaciones de pico seleccionadas en plasma agregadas en cada pico. b, Representación esquemática de mutaciones en proteínas de pico VOC/VOI SARS-CoV-2 que ocurren naturalmente.
a – c, Potencia de neutralización comparativa (valores NT50) de plasmas de convalecientes aleatorios (Ran1-21) y de receptores de vacunas (Vac1-14) contra WT (símbolos grises) y el polimutante sintético de SARS-CoV-2 indicado (a), natural variante (b) o sarbecovirus (c) (símbolo rojo) pseudotipos de VIH-1. Para todos los paneles, se traza la mediana ± rango de dos experimentos independientes.
Datos fuente
a-c, potencia de neutralización comparativa (valores NT50) de plasma de convaleciente (RU27) de alto título contra WT (símbolos grises) y polimutante indicado (a), variante natural de SARS-CoV-2 (b) o sarbecovirus (c) (símbolo rojo ) Pseudotipos del VIH-1. Para todos los paneles, se traza la mediana ± rango de dos experimentos independientes.
Datos fuente
a, Potencia de neutralización (valores NT50) de plasmas de convalecientes aleatorios (símbolos grises) o plasmas ITV (símbolos rojos) contra el prototipo o variante de SARS-CoV-2 o pseudotipos de sarbecovirus VIH-1. Se traza la mediana de dos experimentos independientes. La línea discontinua indicó la mediana de NT50 para plasmas de convalecientes aleatorios contra el SARS-CoV-2 de Wuhan-Hu-1. Los números sobre cada diagrama de dispersión indican la mediana NT50 en relación con la mediana NT50 para Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2. b, Diversidad de secuencias en los dominios de picos de sarbecovirus; El SARS-CoV-2 y las secuencias de picos de sarbecovirus indicadas se alinearon con Clustal y se compararon utilizando Simplot; el porcentaje de identidad relativo al SARS-CoV2 se trazó dentro de una ventana móvil de 100 aminoácidos.
Sustituciones enriquecidas en rVSV/SARS-CoV-2 tras selección en plasma neutralizante. Sustituciones tabuladas de picos de SARS-CoV-2 y sus frecuencias en rVSV/SARS-CoV-2 después del paso en cada una de las muestras de plasma RU27.
Reimpresiones y permisos
Schmidt, F., Weisblum, Y., Rutkowska, M. et al. Alta barrera genética al escape de anticuerpos neutralizantes policlonales del SARS-CoV-2. Naturaleza 600, 512–516 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-04005-0
Descargar cita
Recibido: 01 de julio de 2021
Aceptado: 07 de septiembre de 2021
Publicado: 20 de septiembre de 2021
Fecha de emisión: 16 de diciembre de 2021
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-04005-0
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