La retroalimentación de anticuerpos regula la memoria inmune después del SARS

Nature volumen 613, páginas 735–742 (2023)Cite este artículo

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La inhibición por retroalimentación de la inmunidad humoral mediante anticuerpos se documentó por primera vez en 19091. Estudios posteriores demostraron que, según el contexto, los anticuerpos pueden potenciar o inhibir las respuestas inmunitarias2,3. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo los anticuerpos preexistentes influyen en el desarrollo de las células B de memoria. Aquí examinamos la respuesta de las células B de memoria en individuos que recibieron dos anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2 de alta afinidad y posteriormente dos dosis de una vacuna de ARNm4,5,6,7,8. Descubrimos que los receptores de los anticuerpos monoclonales produjeron títulos de unión a antígeno y de neutralización que eran sólo fraccionalmente más bajos en comparación con los de los individuos de control. Sin embargo, las células B de memoria de los individuos que recibieron los anticuerpos monoclonales diferían de las de los individuos de control en que expresaban predominantemente anticuerpos IgM de baja afinidad que portaban un pequeño número de mutaciones somáticas y mostraban una especificidad objetivo del dominio de unión al receptor (RBD) alterada, consistente con enmascaramiento de epítopos. Además, sólo 1 de cada 77 anticuerpos anti-memoria RBD analizados neutralizó el virus. El mecanismo subyacente a estos hallazgos se examinó en experimentos con ratones que mostraron que los centros germinales formados en presencia de los mismos anticuerpos estaban dominados por células B de baja afinidad. Nuestros resultados indican que los anticuerpos preexistentes de alta afinidad predisponen la selección de células B del centro germinal y de memoria a través de dos mecanismos distintos: (1) reduciendo el umbral de activación de las células B, permitiendo así que abundantes clones de menor afinidad participen en la respuesta inmune; y (2) mediante el enmascaramiento directo de sus epítopos afines. Esto puede explicar en parte el cambio en el perfil objetivo de los anticuerpos de memoria provocados por las vacunas de refuerzo9.

Para examinar cómo la administración pasiva de anticuerpos monoclonales podría influir en las respuestas humorales posteriores a la vacunación en humanos, estudiamos a un grupo de 18 voluntarios sanos que recibieron una dosis única de una combinación de dos anticuerpos monoclonales de acción prolongada contra el SARS-CoV-2 y posteriormente recibieron dos dosis de una vacuna de ARNm del SARS-CoV-2 (Fig. 1a). Los 2 anticuerpos, C144-LS y C135-LS, se unen a los epítopos de clase 2 y 3 en el RBD de la proteína pico (S) del SARS-CoV-2 con alta afinidad (constante de disociación (Kd) = 18 nM y Kd = 6 nM, respectivamente) y neutralizar el virus con valores de concentración inhibidora media máxima (IC50) de 2,55 y 2,98 ng ml-1, respectivamente5,8.

a, Esquema del diseño del estudio, con marcadores que indican semanas en relación con el momento de la primera dosis de vacuna. mAb, anticuerpo monoclonal. b, Se muestran los niveles séricos de C135-LS (arriba, azul) y C144-LS (abajo, rojo) a lo largo del tiempo. Las líneas discontinuas de colores gruesos indican las concentraciones séricas medianas entre los receptores de anticuerpos monoclonales (n = 18), y las líneas finas de puntos negros representan participantes individuales. Las dos líneas verticales continuas indican el valor medio y las áreas sombreadas en gris indican el intervalo de tiempo desde la administración del anticuerpo monoclonal hasta la vacunación. c – f, título de unión plasmática medio máximo (BT50) a RBD después de una (vax 1) y dos dosis (vax 2) de vacunación con ARNm para receptores de anticuerpos monoclonales (n = 18, verde) y controles (n = 26, azul). Cada punto representa un individuo. Las líneas horizontales discontinuas representan la actividad de unión media de muestras de plasma prepandémicas de individuos sanos que se utilizaron como controles negativos. Títulos de unión de c, d, IgM (c) e IgG (d) a WT RBD. e, unión de IgG a RBD R346S/E484K (izquierda) y N440K/E484K (datos ampliados, figura 1). f, unión de IgG al NTD. g – i, valores del título neutralizante medio máximo (NT50) en plasma para receptores de anticuerpos monoclonales (n = 18, verde) y controles (n = 26, azul) contra el VIH-1 pseudotipado con SARS-CoV-2 WT S (g) , R346S/Q493K mutante S (h) y R346S/N440K/E484K mutante S (i) (Datos ampliados, Fig. 2). La proteína S en los pseudovirus en g – i contenía una sustitución R683G. Las barras horizontales rojas en c – i y los números rojos en g – i representan los valores medianos. La significación estadística en c – i se determinó mediante pruebas U de Mann-Whitney de dos colas que comparan las diferencias entre los receptores de anticuerpos monoclonales y los controles para cada punto temporal de forma independiente; Los valores de P se muestran encima de los gráficos. Todos los experimentos se realizaron al menos por duplicado.

Entre el 13 de enero y el 3 de marzo de 2021, 23 personas sin experiencia previa con SARS-CoV-2 recibieron C144-LS y C135-LS (n = 21) o placebo (n = 2) en un primer ensayo clínico de fase 1 en humanos en el Hospital de la Universidad Rockefeller (ClinicalTrials.gov: NCT04700163). Los anticuerpos se modificaron para extender su vida media introduciendo las mutaciones M428L y N343S en sus dominios Fc10 (LS). Los individuos recibieron una dosis única de anticuerpos IgG1 C144-LS y C135-LS en una proporción de 1:1, comenzando con 100 mg de cada uno por vía subcutánea (sc) en el grupo de dosis más baja y hasta 15 mg por kg por vía intravenosa (iv) en el grupo de dosis más alta. Los participantes fueron seguidos longitudinalmente para evaluar la seguridad y tolerabilidad de los anticuerpos monoclonales infundidos y determinar sus propiedades farmacocinéticas.

Un total de 18 de los 21 participantes del estudio de fase 1 que habían recibido los anticuerpos monoclonales eligieron recibir la vacuna de ARNm del SARS-CoV-2 y se ofrecieron como voluntarios para inscribirse en un estudio observacional paralelo que evaluaba sus respuestas inmunes a la vacunación contra el SARS-CoV-2 (suplementario). Tablas 1 y 2). La primera y segunda dosis de vacuna se administraron una mediana de 82 (rango, 42 a 110) y 103 (rango, 70 a 131) días después de la administración de anticuerpos (Tablas complementarias 1 y 2). En el momento de la vacunación, los niveles plasmáticos de C144-LS y C135-LS estaban entre 5 y 100 µg ml-1 dependiendo del grupo de dosificación (Fig. 1b). Las vidas medias estimadas de C144-LS y C135-LS fueron de 69 a 99 días y de 73 a 95 días, respectivamente.

Los 18 receptores de anticuerpos vacunados se compararon con una cohorte de 31 receptores de vacunas de ARNm seleccionados al azar sin antecedentes de infección9,11 (Fig. 1a y Tabla complementaria 1). Se tomaron muestras de ambos grupos entre 13 y 28 (mediana, 19) y entre 15 y 91 (mediana, 29) días después de la primera y segunda dosis de vacuna, respectivamente. Las dos cohortes fueron relativamente parecidas en cuanto a características demográficas y formulación de la vacuna (Tablas complementarias 1 y 2), y ninguno de los individuos incluidos en el estudio se seroconvirtió a nucleocápside (N) en ningún momento durante el período de observación, lo que sugiere que permanecieron sin infección previa.

La actividad de unión de anticuerpos IgM e IgG en plasma contra RBD se midió con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando Wuhan-Hu-1 (tipo salvaje (WT)) y formas mutantes de RBD (R346S/E484K y N440K/E484K) que elimine la unión de C144 y C135, pero no la clase 1 o 4, o algunos anticuerpos de clase 2 o 3 madurados por afinidad9,12 (Datos ampliados, figuras 1a a f). Cuando se midió la unión de WT RBD después de una o dos dosis de vacuna, los títulos de IgM de los receptores de anticuerpos monoclonales no fueron significativamente diferentes en comparación con los controles (Fig. 1c). Por el contrario, los títulos de IgG anti-WT-RBD fueron significativamente más altos en los receptores de anticuerpos monoclonales en comparación con los controles después de una dosis de vacuna, pero se igualaron después de la segunda dosis (Fig. 1d; P <0,0001 y P = 0,93, respectivamente). La diferencia inicial se atribuyó a los anticuerpos monoclonales infundidos porque, cuando las mismas muestras se analizaron contra RBD mutantes R346S/E484K o N440K/E484K que interfieren con la unión de C144 y C135, los niveles de anticuerpos IgG en plasma en las muestras del receptor de anticuerpos monoclonales fueron ligeramente, aunque no significativamente, más bajo que los controles (Fig. 1e). Por el contrario, la contribución relativa de los anticuerpos anti-RBD endógenos aumentó con el tiempo, como lo ilustra una disminución en la correlación entre los niveles séricos de anticuerpos monoclonales y la unión al plasma (Datos ampliados, Fig. 1g, h).

Para determinar si los anticuerpos preexistentes contra el RBD interferían con la inmunidad humoral a dominios independientes de la proteína S del SARS-CoV-2, se analizó la unión de las mismas muestras de plasma al dominio N-terminal (NTD). Los títulos de IgG para el NTD fueron similares en los receptores y controles de anticuerpos monoclonales (Fig. 1f). Concluimos que los altos niveles circulantes de C144-LS y C135-LS no interfieren con las respuestas de anticuerpos IgM anti-RBD y tienen solo un pequeño efecto sobre las respuestas de IgG. Por lo tanto, los anticuerpos infundidos no eliminan el antígeno de la vacuna ni interfieren de manera mensurable con su capacidad general para producir una respuesta inmune13.

Para evaluar la actividad neutralizante del plasma, utilizamos VIH-1 pseudotipado con proteínas WT o S mutantes que portan una mutación en el sitio de escisión de furina (R683G)14. Como se esperaba, según la cantidad de C144-LS y C135-LS en circulación, los títulos neutralizantes contra WT fueron significativamente mayores en los receptores de anticuerpos monoclonales en comparación con los controles en ambos momentos (Fig. 1g; P <0,0001). Para determinar la contribución de la respuesta neutralizante endógena a epítopos fuera de los sitios objetivo C144-LS y C135-LS, utilizamos virus pseudotipados con proteínas S que contienen las mutaciones R346S/Q493K y R346S/N440K/E484K que suprimen la actividad neutralizante de los dos anticuerpos monoclonales infundidos (Datos ampliados, figuras 2a a d). A pesar del dominio inicial de los epítopos de clase 1-2 entre los anticuerpos neutralizantes provocados por la vacunación con ARNm6, el título neutralizante de los plasmas de control contra los dos pseudovirus mutantes fue comparable a los contra el WT (Fig. 1h, i), lo que sugiere que una proporción significativa de anticuerpos neutralizantes endógenos circulantes no se ven afectados por las mutaciones R346S/Q493K y R346S/N440K/E484K. Después de la primera dosis de vacuna, los receptores de anticuerpos monoclonales mostraron títulos neutralizantes significativamente más bajos contra los pseudovirus mutantes en comparación con los controles (2,7 veces y 3,5 veces para R346S/Q493K y R346S/N440K/E484K; Fig. 1h,i; P = 0,0015 y P = 0,014, respectivamente). De acuerdo con un informe reciente13, la actividad neutralizante mejoró y ya no fue significativamente diferente en comparación con los controles después de la segunda dosis de vacuna (Fig. 1h,i). De manera similar, no vimos diferencias perceptibles en la neutralización plasmática de la variante BA.4/5 antigénicamente divergente, que mostró niveles iguales de evasión inmune a los anticuerpos plasmáticos en ambos grupos (Datos ampliados, figura 2e). En conclusión, los receptores de C144-LS y C135-LS tuvieron altos niveles iniciales de actividad neutralizante sérica debido a los anticuerpos administrados pasivamente y desarrollaron sus propios anticuerpos neutralizantes que no eran sensibles a las mutaciones de RBD en los sitios objetivo de C144/C135 después de la vacunación con ARNm. .

Además de las células plasmáticas que producen anticuerpos circulantes, la vacunación también provoca células B de memoria que contribuyen a la protección después de una nueva exposición al patógeno. Estos dos tipos de células se seleccionan mediante mecanismos diferentes y, como resultado, los anticuerpos que producen muestran diferentes niveles de afinidad por el inmunógeno15,16,17. Aunque los efectos de retroalimentación de los anticuerpos sobre las respuestas humorales se han investigado exhaustivamente desde 19091,2, se sabe poco sobre sus efectos sobre el desarrollo de las células B de memoria. Para investigar los efectos de la administración pasiva de anticuerpos monoclonales sobre las respuestas de memoria de las células B en humanos, utilizamos citometría de flujo para enumerar y purificar las células B de memoria circulantes que se unen a los RBD5 marcados con ficoeritrina (PE) y Alexa-Fluor-647 (AF647) (extendido). Datos Fig. 3a – c). La vacunación con ARNm provocó respuestas sólidas de células B de memoria específicas de RBD en los receptores de anticuerpos monoclonales que fueron aproximadamente cuatro y tres veces mayores que en los controles después de la primera y segunda dosis de vacuna, respectivamente (Fig. 2a; P <0,0001 y P <0,0001, respectivamente). . Por lo tanto, la administración de C144-LS y C135-LS aumenta la magnitud de la respuesta de las células B de memoria anti-RBD en comparación con los controles.

a–c, Enumeración por citometría de flujo y expresión de inmunoglobulinas de superficie de células B de memoria específicas de RBD del SARS-CoV-2 después de vax 1 y vax 2, aisladas de receptores de anticuerpos monoclonales (verde, n = 18) e individuos de control9,11 (azul) . n = 26 para vax 1 y n = 31 para vax 2 (a), y n = 10 (byc). Cada punto representa un individuo. Las barras horizontales rojas (y los números en a) muestran los valores medianos. a, el número de células B de memoria específicas de WT RBD por cada 10 millones de células B CD20+ (Datos ampliados, Fig. 3a, b). b,c, El porcentaje de células entre las células B CD20+ que se unen a RBD WT y que expresan IgG (b) o IgM (c) en la superficie celular. d, La distribución de secuencias de anticuerpos derivadas de células aisladas de cinco receptores de anticuerpos monoclonales vacunados después de vax 2 (Datos ampliados, figuras 4a a d). Los números en los círculos interiores indican el número de secuencias analizadas para el individuo respectivo. Las rodajas de color verde indican células expandidas clonalmente (los mismos genes IGHV e IGLV, con CDR3 muy similares) dentro de un individuo. El tamaño del corte es proporcional al número de secuencias relacionadas clonalmente, y la fracción de secuencias expandidas clonalmente se resume como un porcentaje (contorno negro). Las áreas blancas del gráfico circular indican la proporción de secuencias que se aislaron sólo una vez. e, La fracción de células que contienen transcripciones de IgG (negras) versus IgM (blancas) por individuo (ver también Datos ampliados Fig. 4e y refs. 9,11). f,g, Hipermutación somática (SHM) mostrada como sustituciones combinadas de nucleótidos (nt) de región variable de cadena pesada y ligera más una (IGVH + IGVL + 1), donde cada punto representa una secuencia de receptores de anticuerpos monoclonales (verde) o controles (azul). Los diagramas de anillo en la parte inferior muestran la fracción de secuencias sin (IGVH + IGVL + 1 = 1) versus cualquier (IGVH + IGVL + 1 > 1) hipermutación somática, y los números encerrados indican el número de secuencias analizadas para todas las células independientemente. de isotipo (f), y para IgM e IgG analizados de forma independiente (g). Las barras horizontales rojas y los números en f y g indican los valores medios. La significación estadística se determinó mediante pruebas U de Mann-Whitney de dos colas (a-c y f), pruebas de Kruskal-Wallis con la posterior corrección de Dunn para comparaciones múltiples (g) y pruebas exactas de Fisher de dos colas para comparar fracciones (f y g ).

Las células B de memoria humana representan un conjunto diverso de células que pueden desarrollarse en centros germinales o mediante una vía extrafolicular independiente del centro germinal18,19,20. Las células B de memoria que expresan anticuerpos de cambio de clase y altamente mutados somáticamente son principalmente de origen del centro germinal19,21. Las células B de memoria que expresan IgM, que expresan anticuerpos que solo portan una pequeña cantidad de mutaciones, generalmente se desarrollan a través de una vía independiente del centro germinal22,23,24,25. En los individuos de control, las células de memoria específicas de RBD que expresaban IgG constituían la mayor parte del conjunto de células B de memoria en ambos momentos analizados. De acuerdo con el aumento general de células de memoria anti-RBD, el número absoluto de células que expresan IgG aumentó fraccionalmente en los receptores de anticuerpos monoclonales (Datos ampliados, figura 3d). Sin embargo, su contribución relativa se redujo significativamente en ambos momentos, representando solo el 30% y el 45% de las células específicas de RBD en los receptores de anticuerpos monoclonales después de una y dos dosis, respectivamente (Fig. 2b; P = 0,0002 y P <0,0001). . De acuerdo con la disminución relativa de las células B de memoria IgG+, más de la mitad (57 %) de las células B de memoria específicas de RBD de receptores de anticuerpos monoclonales dieron positivo para IgM en la superficie celular después de la primera dosis de la vacuna y esto disminuyó solo ligeramente al 49 %. después de la segunda dosis de vacuna. Por el contrario, se encontraron pocas células de este tipo en el grupo de control en ese momento (Fig. 2c y Datos ampliados Fig. 3e; todos P <0,0001). La relación de isotipos asimétrica se correlacionó con la concentración sérica de C144 en el momento de la inmunización (Datos ampliados, figuras 3f-i). Concluimos que los anticuerpos anti-RBD de alta afinidad preexistentes alteran la respuesta inmune a la vacunación con ARNm del SARS-CoV-2 para favorecer el desarrollo de células B de memoria que expresan IgM.

Para obtener más información sobre los efectos de los anticuerpos preexistentes en la respuesta de la memoria humana a la vacunación con ARNm del SARS-CoV-2, purificamos células B de memoria específicas de RBD de cinco receptores de anticuerpos monoclonales representativos después de la segunda dosis de la vacuna (Datos ampliados, Fig. 4a,b). Se examinaron un total de 353 y 856 secuencias de anticuerpos pareadas de receptores de anticuerpos monoclonales y controles previamente caracterizados, respectivamente (Fig. 2d, Datos ampliados, Fig. 4c-e y Tabla complementaria 3). Las transcripciones de IgM representaron del 70 al 94% de las secuencias recuperadas de receptores de anticuerpos monoclonales y un promedio del 9% pertenecía a clones expandidos (Fig. 2d (arriba) y 2e). Por el contrario, las transcripciones de IgG representaron más del 90% de las secuencias de inmunoglobulinas aisladas de los controles (Fig. 2e y Datos ampliados, Fig. 4e). El enriquecimiento relativo de IgM fue más pronunciado mediante el ensayo de PCR más sensible y puede incluir células que ya no expresan IgM en su superficie. Las células de memoria IgM que se originan en la vía extrafolicular del centro no germinal generalmente están menos mutadas somáticamente que las células de memoria IgG porque sufren menos divisiones19,25. De acuerdo con esta idea, y con la proporción inversa de células B de memoria IgM e IgG en receptores de anticuerpos monoclonales, los anticuerpos obtenidos de estos individuos mostraron significativamente menos mutaciones somáticas en comparación con los controles (Fig. 2f; P <0,0001). Sin embargo, al comparar las células IgM o IgG de forma independiente, la carga mutacional promedio no fue significativamente diferente entre los receptores de anticuerpos monoclonales y los controles (Fig. 2g; P > 0,99 y P = 0,40 para IgM e IgG, respectivamente). Por lo tanto, las células B que expresan IgM e IgG en individuos vacunados que habían recibido C144-LS y C135-LS portan un número normal de mutaciones somáticas, pero la proporción relativa de los dos tipos de células de memoria se invierte, lo que explica el nivel general más bajo. de mutación en su compartimento de memoria. Finalmente, a diferencia de los controles, no hubo enriquecimiento para las cadenas pesadas VH3-53, VH1-69, VH1-46 y VH3-66, que a menudo se dirigen a epítopos de clase 1 y 2. En cambio, hubo un enriquecimiento relativo para los genes VH3-9, VH5-51, VH4-39 y VH1-8 (Datos ampliados, figura 4f). El número limitado de células secuenciadas impide sacar conclusiones definitivas sobre la distribución precisa de clonotipos en esta población, pero el cambio relativo en la frecuencia de uso del gen VH implica que el reclutamiento de células B en el compartimento de memoria de los receptores de anticuerpos monoclonales está alterado. En resumen, los datos sugieren que los anticuerpos preexistentes pueden alterar la composición celular y molecular del compartimento MBC específico de RBD que se desarrolla en respuesta a la vacunación con ARNm.

Para examinar la actividad vinculante y neutralizante de los anticuerpos de memoria provocados por la vacunación con ARNm en receptores C144-LS y C135-LS, produjimos 178 anticuerpos monoclonales representativos obtenidos de cinco individuos como IgG y los probamos para determinar su unión al WT SARS-CoV-2. RBD usando ELISA (Fig. 3a-c y Tabla complementaria 4). A diferencia de los controles, de los cuales más del 95% de los anticuerpos de memoria se unían fuertemente al RBD, los anticuerpos monoclonales aislados de voluntarios que recibieron C144-LS y C135-LS mostraron diversos niveles de actividad de unión. Aproximadamente una cuarta parte (24 %) de los anticuerpos mostraron una unión relativamente pobre, con concentraciones efectivas medio máximas de ELISA (CE50) que estaban sólo ligeramente por encima de nuestro límite de detección, y un poco más de un tercio (38 %) no mostraron niveles detectables. vinculante sobre el fondo (Fig. 3a, b). En consecuencia, la mediana (CE50) de los anticuerpos aislados de los receptores de anticuerpos monoclonales fue significativamente mayor que en los controles (Fig. 3b; P <0,0001). En particular, esta diferencia siguió siendo significativa cuando los anticuerpos monoclonales aislados de células de memoria IgM e IgG se analizaron de forma independiente (Fig. 3c; P = 0,0005 y P <0,0001, respectivamente).

a – c, unión del anticuerpo monoclonal a WT RBD. a, se muestra la unión ELISA de anticuerpos monoclonales con memoria derivados de receptores de anticuerpos monoclonales. Cada curva representa un anticuerpo. Las curvas verdes muestran valores de CE50 de <10 µg ml-1; las líneas discontinuas grises muestran valores de CE50 de >10 µg ml-1; las líneas negras continuas son anticuerpos que estaban por debajo o iguales al anticuerpo anti-VIH1 de control negativo 3BNC117 (línea discontinua amarilla gruesa). Se utilizó C144 (línea discontinua roja gruesa) como control positivo. b, valores de CE50 derivados de a para receptores de anticuerpos monoclonales (verde) y controles (azul) para todos los anticuerpos, independientemente del isotipo. c, valores de CE50 como en b, pero IgM e IgG se analizaron de forma independiente. El área sombreada en gris entre las líneas de puntos horizontales indica anticuerpos con EC50 > 10 µg ml-1 (unión deficiente) y anticuerpos que no se unen, agrupados arbitrariamente en 10 y 20 µg ml-1, respectivamente. Los diagramas de anillos resumen la fracción de todos los anticuerpos analizados para los grupos respectivos (número rodeado por un círculo). d, valores de CI50 para todos los anticuerpos monoclonales aislados de receptores de anticuerpos monoclonales vacunados (verde) o de individuos de control (azul). Los diagramas de anillos ilustran la fracción de anticuerpos no neutralizantes (no neutros; IC50 > 1000 ng ml-1) (rebanadas negras) entre todos los anticuerpos analizados para el grupo respectivo (número rodeado por un círculo). e, valores de IC50 como se describe en d, pero los anticuerpos IgM e IgG se analizaron de forma independiente. f – l, Unión de anticuerpo monoclonal a antígeno monomérico y multimerizado mediante BLI. f, Esquema de mediciones de unión monomérica en las que se inmovilizó IgG en el chip biosensor y posteriormente se expuso a RBD monomérico (arriba) y unión multimérica utilizando trímeros de proteína WT SARS-CoV-2 S estabilizados con 6P que se habían tetramerizado con estreptavidina (abajo). ). g, trazas de BLI obtenidas en condiciones monovalentes como se muestra en f (arriba). Cada curva representa un anticuerpo. Las líneas continuas coloreadas indican la unión sobre el fondo representado por el anticuerpo polirreactivo ED3835 (línea negra discontinua) y el anticuerpo anti-VIH-1 3BNC117 (línea negra discontinua). Las líneas grises muestran anticuerpos que no se unen. Se utilizó C144 (línea discontinua roja gruesa) como control positivo. h, trazas de BLI como se describe en g para anticuerpos que no mostraron unión mensurable en g y posteriormente se analizaron para determinar su unión en condiciones polivalentes como se ilustra en f (abajo). i, El porcentaje de anticuerpos de unión en condiciones monovalentes para todos los anticuerpos y por isotipo. Los valores debajo de las barras indican la cantidad de anticuerpos analizados. j, el porcentaje de anticuerpos de unión como se describe en i para los anticuerpos que se muestran en h. k, valores de Kd derivados en condiciones de unión monomérica en g para receptores de anticuerpos monoclonales (verde) y controles (azul) independientemente del isotipo. Los diagramas de anillos ilustran la fracción de anticuerpos analizados para el grupo respectivo (número rodeado con un círculo) que se unieron de manera mensurable a RBD monomérico (unión, blanco) y aquellos para los cuales no se pudo establecer un valor de Kd (sin Kd, negro). l, los valores de Kd descritos en k se analizaron de forma independiente para IgM e IgG. m, Esquema del experimento de competencia BLI: (1) el anticuerpo de captura de especificidad de epítopo conocida (anticuerpo de referencia de clase) se unió al chip biosensor; (2) expuesto al antígeno; y (3) se añadió el anticuerpo de interés al chip. n, la distribución de los epítopos objetivo. El número en el centro es la cantidad de anticuerpos analizados. Las rodajas coloreadas en tonos de rojo y azul representan epítopos de clase 1, 2 y 3 o combinados, y los tonos de gris representan epítopos que contienen clase 4 o epítopos que no se pudieron clasificar. Para b – e, k y l, las barras horizontales rojas y los números representan los valores medianos. ND, no determinado. La significación estadística se determinó mediante pruebas U de Mann-Whitney de dos colas (b, d y k), pruebas de Kruskal-Wallis con posterior corrección de Dunn para comparaciones múltiples (c, e y l), pruebas exactas de Fisher de dos colas (d, e, k y l) y el estadístico de contingencia bilateral χ2 (b, c y n).

Se analizó la actividad neutralizante de los anticuerpos de memoria obtenidos de receptores C144-LS y C135-LS que se unieron a WT SARS-CoV-2 RBD con valores de EC50 de <10 µg ml-1 contra virus pseudotipados con WT S. Mientras que casi dos tercios ( El 63%) de los anticuerpos IgG y el 17% de los anticuerpos IgM aislados de los controles mostraron actividad neutralizante mensurable; solo 1 de 45 anticuerpos derivados de IgG y ninguno de los 32 anticuerpos derivados de IgM obtenidos de receptores C144-LS y C135-LS se neutralizaron. SARS-CoV-2 (Fig. 3d, e). Por lo tanto, los anticuerpos aislados del compartimento de células B de memoria específico de RBD de receptores de anticuerpos monoclonales vacunados muestran una actividad neutralizante significativamente menor en comparación con los anticuerpos aislados de los controles. En circulación, los anticuerpos IgM son pentámeros que, además de su capacidad superior para fijar el complemento, muestran afinidades aparentes aumentadas. Para probar si las propiedades de unión y neutralización de los anticuerpos IgM mejorarían cuando se expresaran como pentámeros, reexpresamos 17 anticuerpos de memoria IgM (15 de receptores de anticuerpos monoclonales y 2 de controles) como IgM pentaméricas. Aunque los pentámeros obtenidos de receptores de anticuerpos monoclonales mostraron una unión significativamente mejorada a RBD mediante ELISA (Datos ampliados, figura 5a y tabla complementaria 4; P = 0,0004), siguieron siendo incapaces de neutralizar (datos ampliados, figura 5b y tabla complementaria 4). Por el contrario, ambos anticuerpos IgM de control mostraron una potencia neutralizante mejorada cuando se expresaron como pentámeros (Datos ampliados, figura 5b).

Para examinar la afinidad de los anticuerpos, realizamos experimentos de interferometría de biocapa (BLI) en los que se inmovilizaron anticuerpos monoclonales en el chip biosensor y se expusieron a monómeros WT RBD12 (Fig. 3f, g). A diferencia de los anticuerpos derivados de los individuos de control, para los cuales el 96% de los anticuerpos analizados mostraron afinidades mensurables, solo dos tercios (67%) de los anticuerpos derivados de receptores de anticuerpos monoclonales lo hicieron (Fig. 3g,i,k; P < 0,0001). Cuando todos los anticuerpos se consideraron juntos, la afinidad media (constante de afinidad (Kd)) difirió en casi un orden de magnitud entre los receptores de anticuerpos monoclonales y los controles (Fig. 3k; P <0,0001). Además, esta diferencia siguió siendo significativa cuando los anticuerpos monoclonales IgM e IgG se consideraron de forma independiente (Fig. 3l; P = 0,0058 y P <0,0001, respectivamente), lo que indica que las menores afinidades observadas en el compartimento de la memoria de los receptores de anticuerpos monoclonales no pueden explicarse únicamente por la preponderancia de IgM.

C144-LS y C135-LS tienen el potencial de formar complejos inmunes con el antígeno de la vacuna in vivo y presentarlo como un multímero que podría aumentar la afinidad aparente de una célula B por el antígeno multimerizado mediante efectos de avidez. Para determinar si los anticuerpos derivados de células de memoria de receptores de anticuerpos monoclonales sin afinidad aparente por el antígeno monomérico mostrarían unión en condiciones de valencia más alta, expusimos los anticuerpos monoclonales inmovilizados a trímeros de S tetramerizados con biotina-estreptavidina (Fig. 3f, h, j). ). De los 25 anticuerpos sin unión monomérica aparente probados, 23 (92%) se unieron a S multimerizado (Fig. 3h, j). Concluimos que la mayoría de los anticuerpos anti-RBD aislados de receptores de anticuerpos monoclonales que no mostraron una unión detectable a los monómeros de RBD se unen al antígeno multimerizado. Por tanto, la ausencia de unión al antígeno monomérico es consecuencia de la afinidad relativamente baja de los anticuerpos con memoria derivados de receptores de anticuerpos monoclonales y no se debe a una especificidad alterada.

Para examinar los epítopos a los que se dirigen los anticuerpos anti-RBD provocados por la vacuna producidos por las células B de memoria de los receptores C144-LS y C135-LS, realizamos experimentos BLI en los que se utilizó un complejo anticuerpo preformado-RBD que comprende uno de los cuatro anticuerpos caracterizados estructuralmente8,26 ,27 fue expuesto a un segundo anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo desconocido (Fig. 3m y Datos ampliados Fig. 6). Un total del 49% de los anticuerpos anti-memoria RBD obtenidos de controles vacunados se dirigen a epítopos de clase 1, 2 o 3 o combinaciones de los mismos9,11 (Fig. 3n y Datos ampliados Fig. 6a-f). Por el contrario, sólo el 20% de los anticuerpos de memoria obtenidos de receptores de anticuerpos monoclonales se dirigieron a epítopos de clase 1 o 2, y ninguno fue específico de clase 3. En cambio, encontramos que el 78% de estos anticuerpos se dirigieron a epítopos que contienen clase 4 o a epítopos que no pudieron clasificarse con nuestro método (Fig. 3n y Datos ampliados, Fig. 6a-f). Por lo tanto, hubo un cambio significativo en la distribución de los epítopos a los que se dirigen los anticuerpos de memoria aislados de receptores de anticuerpos monoclonales en comparación con los controles (Fig. 3n; P = 0,0089). En conclusión, C144-LS y C135-LS alteran el desarrollo de células B de memoria que expresan anticuerpos anti-RBD y su preferencia de epítopo objetivo.

Para examinar el mecanismo por el cual los anticuerpos preexistentes alteran la selección de células B de memoria, inmunizamos ratones WT C57BL/6 a los que se les preinfundió C135 y C144 o un cóctel de anticuerpos monoclonales anti-VIH irrelevante con RBD de SARS-CoV-2 recombinante (Fig. 4a). Los ratones que fueron pretratados con anticuerpos anti-VIH de control desarrollaron respuestas del centro germinal en las que un promedio del 27% de las células B se unieron a RBD (Fig. 4b, cy Datos ampliados Fig. 7a-d). Aunque el tamaño del centro germinal no se alteró en ratones que recibieron C135 y C144 (Fig. 4b y Datos ampliados, Fig. 7c), la fracción de células de unión a RBD se redujo significativamente (Fig. 4c y Datos ampliados, Fig. 7b, d; P = 0,041).

a, Esquema de la configuración experimental. Los ganglios linfáticos poplíteos (dLN) agrupados se analizaron mediante citometría de flujo (Datos ampliados, figura 7 y métodos). b, c, Enumeración de células B del centro germinal (CD38-FAS+GL7+) como una fracción de todas las células B B220+ (b) y células de unión a RBD como una fracción de células del centro germinal B (GCB) (c). d,e, Secuencias de anticuerpos de células B de un solo centro germinal. d, La distribución de secuencias de anticuerpos. Los números rodeados indican el número de secuencias analizadas por animal. Los cortes sólidos del gráfico circular indican secuencias expandidas clonalmente, con cortes coloreados en tonos de azul (controles) o verde (grupo de anticuerpos monoclonales anti-RBD) que indican clones de unión (Datos ampliados, figura 7b y tabla complementaria 5). Las rodajas grises indican clones no vinculantes. Las secuencias que aparecen sólo una vez están punteadas (vinculantes) o blancas (no vinculantes). e, La contribución relativa de la unión de clones y singletes en d. f – i, Unión de fragmentos Fab monoclonales derivados de células B del centro germinal a RBD monomérico según se determina mediante BLI. f, La configuración de BLI. g,h, trazas de fragmentos Fab derivados de controles (g) y ratones tratados con anti-RBD (h). Cada curva representa una Fab. Las líneas continuas coloreadas indican la unión sobre el fondo representado por el anticuerpo polirreactivo ED3835 (línea negra discontinua) y el anticuerpo de control negativo mGO53 (línea negra discontinua). Las líneas grises muestran anticuerpos que no se unen. Se utilizó C144 (línea gruesa de trazos rojos) como control positivo. i, El porcentaje de fragmentos Fab de unión, con el número total de fragmentos Fab analizados del control (n = 47) y del grupo de anticuerpos monoclonales anti-RBD (n = 46) indicados a continuación. Para b – i, los ratones de control pretratados con anticuerpos monoclonales anti-VIH irrelevantes (3BNC117 y 10-1074, n = 6) se muestran en azul, y los ratones que recibieron una combinación de C135 y C144 (n = 6) se muestran en verde . Para b, cye, los puntos de colores representan ratones individuales y las líneas horizontales rojas indican los valores medianos. La significación estadística se determinó mediante pruebas U de Mann-Whitney de dos colas (b, cye) y pruebas exactas de Fisher de dos colas (i).

Para examinar la naturaleza molecular de los anticuerpos de memoria producidos en presencia de anticuerpos de alta afinidad preexistentes, clonamos y produjimos anticuerpos a partir de células B del centro germinal. Se obtuvieron un total de 351 y 352 anticuerpos de los grupos de control tratados con anti-RBD y tratados con anti-VIH, respectivamente (Tabla complementaria 5). Las células B aisladas de ambos grupos mostraron niveles similares de mutación somática (Datos ampliados, Fig. 7e) y expansión clonal (Fig. 4d y Datos ampliados, Fig. 7f). Sin embargo, en los receptores C135 y C144, las células B únicas y clonalmente expandidas estaban dominadas por células que no se unían al RBD, según lo determinado mediante citometría de flujo (Fig. 4d, e; P = 0,046 y P = 0,026, respectivamente).

Se expresaron un total de 106 anticuerpos monoclonales como fragmentos de unión a antígeno (Fab) (Tabla complementaria 6) y se analizó su unión al RBD del SARS-CoV-2 mediante BLI (Fig. 4f). En condiciones de unión monomérica, el 46% (22 de 47) de los fragmentos Fab derivados de los ratones de control se unieron al RBD (Fig. 4g). Por el contrario, solo el 21% (8 de 46) de los anticuerpos de células B del centro germinal de los ratones que fueron pretratados con C135 y C144 mostraron una afinidad mensurable pero demostrablemente menor en estas condiciones (Fig. 4g-i; P = 0,0036 y extendido Datos Fig. 7g). Por lo tanto, nuestros experimentos de inmunización en ratones muestran que los anticuerpos preexistentes de alta afinidad reducen el umbral de afinidad para la participación de las células B en las respuestas inmunes y, por lo tanto, proporcionan una explicación mecanicista para la observación de que el compartimento de la memoria en humanos infundidos con C135 y C144 está dominado por células B de baja afinidad.

Nuestros experimentos muestran que los anticuerpos preexistentes alteran el desarrollo de las células B de memoria en respuesta a la vacunación con ARNm del SARS-CoV-2 en humanos. De acuerdo con un informe reciente, C144-LS y C-135-LS no interfirieron significativamente con el desarrollo de anticuerpos circulantes que se unen a epítopos fuera de los sitios objetivo de los dos anticuerpos monoclonales13. Además, aunque encontramos que las respuestas neutralizantes endógenas se redujeron en los receptores de anticuerpos monoclonales después de una dosis, esta diferencia ya no fue significativa después de dos dosis de vacunación con ARNm. Por el contrario, el desarrollo de células B de memoria específicas anti-RBD se vio profundamente alterado. Específicamente, se redujo el umbral de afinidad para la entrada en el compartimiento de células B del centro germinal y de memoria en humanos y ratones, y hubo un cambio en los epítopos objetivo en presencia de anticuerpos preexistentes.

Las células de memoria que expresan anticuerpos IgG específicos de epítopos de clase 1, 2 o 3 normalmente dominan la respuesta anti-RBD después de 2 dosis de vacunación con ARNm4,5,6,7,8. Por el contrario, encontramos que los receptores de anticuerpos monoclonales desarrollaron un mayor número de células de memoria IgM anti-RBD que expresan anticuerpos con especificidad de epítopo alterada consistente con el enmascaramiento de epítopo. Esto también puede explicar el cambio en la especificidad de las células B de memoria de las clases 1 y 2 después de la tercera dosis de las vacunas de ARNm del SARS-CoV-2, que aumenta la amplitud de la respuesta neutralizante9.

A partir de experimentos con anticuerpos contra la toxina diftérica a principios del siglo XX, un extenso trabajo en animales de experimentación demostró que la transferencia pasiva de suero inmune policlonal o anticuerpos monoclonales puede alterar las respuestas inmunes humorales posteriores de una manera específica de epítopo1,2. Más recientemente, se demostró que el enmascaramiento del epítopo mediante anticuerpos preexistentes interfiere con la respuesta plasmablástica específica del epítopo a la vacunación contra la malaria28,29. En los ensayos de la vacuna contra la malaria, una tercera dosis de vacuna produjo una fracción más pequeña de plasmablastos productores de anticuerpos de alta afinidad que la segunda, y esto se atribuyó al enmascaramiento del epítopo. El efecto de enmascaramiento de los anticuerpos de alta afinidad preexistentes se confirmó en ratones transgénicos, lo que demuestra que los anticuerpos de alta afinidad bloquean la entrada de las células B a los centros germinales de una manera específica del epítopo29,30,31. Sin embargo, estos resultados se obtuvieron en el contexto de un repertorio restringido de células B transgénicas y no se examinó el efecto de los anticuerpos preexistentes en el desarrollo de células B de memoria en respuestas policlonales29. Los resultados de nuestros ensayos clínicos y experimentos con ratones concuerdan con la observación de que los anticuerpos preexistentes bloquean el desarrollo de células B específicas de epítopo32,33. Nuestros experimentos amplían las observaciones anteriores porque también examinamos la especificidad y la afinidad de unión al antígeno de los anticuerpos producidos por las células B que responden al antígeno en presencia de un anticuerpo preexistente. En particular, encontramos que los anticuerpos de alta afinidad preexistentes reducen el umbral de afinidad para la participación de las células B en la respuesta inmune. Como resultado, los anticuerpos anti-SARS-CoV2 expresados ​​por las células B de memoria que se desarrollan en humanos que recibieron infusiones de anticuerpos monoclonales antes de la vacunación son predominantemente de baja afinidad. Por el contrario, los anticuerpos policlonales de baja afinidad que surgen después de una vacunación primaria pueden mejorar las respuestas de refuerzo de la vacuna mediante mecanismos que aún no se han dilucidado completamente2,3,31.

Las células B de memoria pueden desarrollarse a través de dos vías diferentes18,19. En los centros germinales se desarrollan células B de memoria con cambio de clase que portan anticuerpos de afinidad relativamente mayor con un gran número de mutaciones somáticas. Por el contrario, las células B de memoria que expresan IgM, que portan anticuerpos de menor afinidad y solo un pequeño número de mutaciones, se desarrollan a través de una vía independiente del centro germinal18,20. Nuestros datos en humanos sugieren que la transferencia pasiva de C144-LS y C135-LS puede favorecer la vía independiente del centro germinal mediante la creación de complejos inmunes (revisado en la referencia 34). Los complejos inmunes atrapan y secuestran antígenos en los órganos linfoides y, por lo tanto, aumentan la concentración local de antígeno. Además, contienen múltiples copias del antígeno en una forma que aumenta la afinidad aparente por efectos de avidez, permitiendo así el reclutamiento de células B con receptores de muy baja afinidad en la respuesta inmune34. Juntos, el aumento de la concentración de antígeno y los efectos de la avidez se combinan para reducir la rigurosidad de la selección y ayudar a explicar el aumento de células B de unión a RBD de baja afinidad que se encuentran en los receptores de anticuerpos monoclonales humanos, ya que esto permite la activación de un mayor número de abundantes células de menor afinidad. clones que de otro modo no serían reclutados para la respuesta inmune. Por tanto, la combinación de enmascaramiento de epítopos y umbrales de afinidad reducidos diversifican las respuestas de células B resultantes.

En conclusión, la composición de los centros germinales y el desarrollo de la memoria en respuesta a la vacunación están influenciados por anticuerpos preexistentes que pueden alterar el perfil objetivo, la afinidad y el isotipo del anticuerpo de las células que responden. La diversificación de la respuesta de anticuerpos a través de este mecanismo puede ayudar a aumentar la amplitud de vacunas como la vacuna contra el SARS-CoV-2, pero interferir con el desarrollo de su amplitud y potencia en otras, como la VIH-1 o la influenza, al desviar la inmunidad de una neutralización generalizada. a epítopos específicos de cepa y al permitir que un número cada vez mayor de precursores de baja afinidad que expresan anticuerpos fuera del objetivo participen en la respuesta inmune.

Los participantes en el grupo receptor de anticuerpos monoclonales eran voluntarios sanos sin experiencia previa con el SARS-CoV-2 que se inscribieron en un primer estudio de fase 1 en humanos en el Hospital de la Universidad Rockefeller de Nueva York y recibieron dosis únicas de dos anti-SARS-CoV. -2 anticuerpos monoclonales RBD, C144-LS y C135-LS, entre el 13 de enero y el 3 de marzo de 2021 (NCT04700163). El ensayo clínico de fase 1 tuvo un diseño de aumento de dosis y evaluó la seguridad y tolerabilidad, así como la farmacocinética de los dos anticuerpos monoclonales. El cóctel de anticuerpos monoclonales (proporción 1:1 de C144-LS y C135-LS) se administró a 21 de los 23 individuos inscritos (n = 2 que recibieron placebo), lo que permitió múltiples análisis de seguridad provisionales. Los anticuerpos monoclonales se administraron a 100 o 200 mg cada uno por vía subcutánea, o a 1, 5 o 15 mg por kg cada uno por vía intravenosa (Tabla complementaria 2). Los participantes elegibles para el estudio de fase 1 eran adultos sanos sin antecedentes de infección o vacunación por SARS-CoV-2, ni haber recibido previamente ningún tratamiento terapéutico contra el SARS-CoV-2, incluidos otros anticuerpos monoclonales o plasma de personas convalecientes. Se pueden encontrar más detalles sobre los criterios de inclusión y exclusión, el diseño del estudio y los criterios de valoración del estudio de fase 1 en ClinicalTrials.gov (NCT04700163). De los 21 individuos que recibieron los anticuerpos monoclonales en el estudio de fase 1, 18 se inscribieron conjuntamente en un estudio observacional paralelo para evaluar sus respuestas inmunes a la posterior vacunación con ARNm del SARS-CoV-2. Un individuo eligió recibir la vacuna Janssen (Ad26.COV2.S) y otro individuo (un receptor de placebo) mostró N cambios en los títulos antes de la inscripción en el estudio observacional que eran compatibles con una infección reciente por SARS-CoV-2, lo que los hacía no elegibles. para su inclusión en este estudio. Los participantes restantes del estudio de fase 1 optaron por no inscribirse en el estudio paralelo de respuestas inmunitarias. Los 18 receptores de anticuerpos monoclonales incluidos en este estudio observacional recibieron las vacunas de ARNm Moderna (Spikevax, mRNA-1273) o Pfizer-BioNTech (Comirnaty, BNT162b2) contra la cepa WT (Wuhan-Hu-1) del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo. 2 (SARS-CoV-2). Los participantes en el grupo de control vacunado eran voluntarios sanos sin experiencia previa con el SARS-CoV-2 que habían recibido dos dosis de una de las dos vacunas de ARNm del SARS-CoV-2 actualmente aprobadas, Moderna (Spikevax, mRNA-1273) o Pfizer-BioNTech ( Comirnaty, BNT162b2). Estos individuos de control habían sido reclutados en el Hospital de la Universidad Rockefeller para realizar donaciones de sangre en serie con el fin de evaluar longitudinalmente sus respuestas inmunitarias a la vacunación con ARNm del SARS-CoV-29,11. Anteriormente informamos los hallazgos obtenidos de este grupo y nos remitimos a las referencias. 9,11 para obtener más detalles sobre el reclutamiento de participantes, los criterios de inclusión y exclusión y las características demográficas (Tablas complementarias 1 y 2). En cada visita de recolección de muestras, los participantes de cualquiera de los grupos se presentaron en el Hospital de la Universidad Rockefeller para la recolección de muestras de sangre y se les pidió que proporcionaran detalles de su régimen de vacunación, posibles efectos secundarios, comorbilidades y posibles antecedentes de COVID-19. Las vacunas se administraron fuera del estudio, a discreción del individuo y su proveedor de atención médica, de acuerdo con las pautas existentes y, como tal, no fueron influenciadas por su participación en nuestro estudio. Se analizaron muestras de plasma basales y longitudinales para determinar la actividad de unión a la proteína de la nucleocápside (N; Sino Biological, 40588-V08B) del SARS-CoV-2. La ausencia de seroconversión hacia N durante el intervalo del estudio se utilizó para excluir la infección por SARS-CoV-2, además del historial informado de los participantes. La recopilación y gestión de datos clínicos se realizó mediante el software iRIS de iMedRIS (v.11.02). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio, que se llevó a cabo de acuerdo con las buenas prácticas clínicas. El estudio se realizó de conformidad con todas las normas éticas pertinentes y los protocolos clínicos (CGA-1015 y DRO-1006) para estudios con participantes humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Rockefeller. Las características detalladas de los participantes se proporcionan en las Tablas complementarias 1 y 2 y en las referencias. 9,11.

Las células mononucleares de sangre periférica obtenidas de muestras recolectadas en la Universidad Rockefeller se purificaron como se informó anteriormente mediante centrifugación en gradiente y se almacenaron en nitrógeno líquido en presencia de suero fetal de ternera (FCS) y dimetilsulfóxido5. Se dividieron en alícuotas muestras de plasma y suero heparinizados y se almacenaron a -20 °C o menos. Antes de los experimentos, se inactivaron térmicamente alícuotas de muestras de plasma (a 56 °C durante 1 h) y luego se almacenaron a 4 °C.

Para evaluar las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos C144-LS y C135-LS administrados pasivamente, se midieron sus niveles de anticuerpos séricos el día de la administración del anticuerpo (día 0) a las 1, 3, 6, 9 y 12 h después de la infusión, y el día 0. días 1, 3, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 126, 168, 252 y 336. Los niveles de C144-LS y C135-LS en el suero se midieron mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS). En resumen, los analitos se aislaron de muestras de suero mediante inmunocaptura utilizando perlas de estreptavidina y proteína RBD biotinilada. Las proteínas aisladas se desnaturalizaron con ditiotreitol, se alquilaron con yodoacetamida y se digirieron con tripsina. El extracto final se analizó mediante cromatografía líquida de alta resolución con cambio de columna y detección MS/MS mediante electropulverización de iones positivos. Para la cuantificación se utilizó un algoritmo de regresión lineal, ponderado 1/concentración2, de mínimos cuadrados. Se utilizó un análisis no compartimental para estimar los parámetros farmacocinéticos a partir de los niveles séricos medidos de C144-LS y C135-LS. Se utilizó Phoenix WinNonlin (v.8.2) para el análisis no compartimental. Se utilizó el tiempo de muestra real después de la administración de cada anticuerpo monoclonal para la estimación de los parámetros farmacocinéticos séricos en lugar del tiempo nominal. Las estimaciones de la vida media fueron similares entre las vías de administración para C144-LS y C135-LS, lo que indica una vida media de 2 a 3 meses para ambos anticuerpos monoclonales por cualquiera de las vías de administración (C144-LS: 68,9 a 99,3 días para los grupos sc y 86,9 a 92,3 días para los grupos iv; C135-LS: 72,7 a 77,9 días para los grupos sc y 70,5 a 94,7 días para los grupos iv). La visualización de los datos farmacocinéticos se realizó en GraphPad Prism, utilizando el modelo de desintegración trifásica.

Se adquirieron ratones C57BL/6J de Jackson. Todos los ratones utilizados eran hembras que tenían entre 6 y 12 semanas de edad al comienzo de los experimentos. Los ratones se alojaron a una temperatura de 22 ºC y una humedad del 30 al 70% en un ciclo de luz y oscuridad de 12 h a 12 h con acceso ad libitum a comida y agua. Las inmunizaciones de las almohadillas plantares se realizaron utilizando 25 µl de PBS 1X que contenía 5 µg de RBD recombinante y 8,5 µl de Alhidrogel al 2 % (Invivogen, 21645-51-2). Se prepararon cócteles de anticuerpos 3BNC117/10-1074 y C135/C144 con 100 µg de cada anticuerpo y se administraron en PBS 1X mediante inyección iv. Todos los procedimientos y experimentos con animales se realizaron sin cegamiento ni aleatorización, y de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Rockefeller (IACUC).

Los ensayos ELISA36,37 para evaluar la unión de anticuerpos al SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 RBD, NTD o S se realizaron recubriendo placas de 96 medios pocillos de alta unión (Corning 3690) con 50 μl por pocillo de 1 μg. ml-1 de solución de proteína en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 ° C. Las placas se lavaron seis veces con tampón de lavado (1 x PBS con 0,05 % de Tween-20 (Sigma-Aldrich)) y se incubaron con 170 µl por pocillo de tampón de bloqueo (1 x PBS con 2 % de BSA y 0,05 % de Tween-20 (Sigma -Aldrich)) durante 1 h a temperatura ambiente. Inmediatamente después del bloqueo, se agregaron anticuerpos monoclonales o muestras de plasma en PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de plasma se analizaron a una dilución inicial de 1:66 y se diluyeron en serie tres o cuatro veces. Los anticuerpos monoclonales se probaron a una concentración inicial de 10 μg ml-1 y 11 diluciones en serie triples adicionales. Las placas se lavaron seis veces con tampón de lavado y luego se incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG o IgM humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immuno Research, 109-036-088 y 109-035-129) en tampón de bloqueo a una Dilución 1:5.000 (IgM e IgG). Las placas se revelaron mediante la adición del sustrato HRP, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Thermo Fisher Scientific) durante 6 minutos. La reacción en desarrollo se detuvo agregando 50 µl de H2SO4 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas ELISA (FluoStar Omega, BMG Labtech) con el software Omega y Omega MARS para análisis. Se incluyeron muestras de control del normalizador en cada placa. Para muestras de plasma y anticuerpos monoclonales, se calcularon los títulos de unión medio máximos (BT50) y las concentraciones efectivas medio máximas (CE50), respectivamente, utilizando un modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros (GraphPad Prism v.9.3) con las siguientes configuraciones: [ agonista] versus respuesta - pendiente variable (cuatro parámetros); abajo = 0; Pendiente > 0; arriba = meseta superior específica del experimento del anticuerpo de control del normalizador o muestra de plasma que alcanza la saturación durante al menos 3 pasos de dilución consecutivos. El ajuste de la curva se limitó a un límite superior que corresponde a la densidad óptica máxima lograda por el control normalizador conocido para limitar la variabilidad entre placas/experimentos (efectos por lotes). Los valores de IgM BT50 pentamérica se establecieron utilizando anticuerpos IgG medidos previamente como controles normalizadores. Se utilizaron muestras de plasma prepandémicas de donantes sanos y anticuerpos monoclonales de control de isotipo como controles negativos, tal como se indica, y se utilizaron para la validación5. Todos los valores de EC50 y BT50 informados son el promedio de al menos dos experimentos independientes.

El vector de expresión en mamíferos que codifica el RBD del SARS-CoV-2 (GenBank MN985325.1; residuos de proteína S 319–539) se describió previamente26. Los plásmidos que codifican las sustituciones R346S/E484K y N440K/E484K se generaron utilizando un kit de mutagénesis dirigida según las instrucciones del fabricante (New England Biolabs (NEB), E0554S). Todas las construcciones se confirmaron mediante secuenciación de Sanger y se usaron para expresar proteínas solubles transfectando transitoriamente células Expi293F (Gibco/Thermo Fisher Scientific, A14527)). Los sobrenadantes se recogieron después de 4 días y las proteínas RBD se purificaron mediante cromatografía de afinidad con níquel. Las proteínas S 6P se purificaron mediante afinidad por níquel seguido de cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones de los picos de la cromatografía de exclusión por tamaño se identificaron mediante electroforesis en gel nativo, y las fracciones de los picos correspondientes a los RBD monoméricos o los trímeros S se combinaron y almacenaron a 4 °C.

Anteriormente se describió un plásmido que expresa SARS-CoV-2 S en el contexto de pSARS-CoV-2-SΔ19 (Wuhan-Hu-1), y un derivado de pSARS-CoV-2-SΔ19 con un sitio de escisión de furina alterado. se generó mediante la introducción de la sustitución R683G6. La alteración del sitio de escisión de furina da como resultado una mayor infectividad de las partículas. Anteriormente se describió un plásmido que expresa SARS-CoV-2 Omicron BA.4/5 S que lleva la sustitución R683G38. Se construyeron dos plásmidos que contenían mutaciones de escape del anticuerpo C135/C144 sobre la base de pSARS-CoV-2-SΔ19 R683G mediante mutagénesis mediada por PCR de extensión superpuesta y ensamblaje de Gibson. En concreto, las sustituciones introducidas fueron las siguientes: R346S/Q493K y R346S/N440K/E484K. Es importante destacar que, a medida que esas sustituciones se incorporaron al fondo de pSARS-CoV-2-SΔ19 R683G, la actividad neutralizante contra todos los pseudovirus mutantes y variantes se comparó con una secuencia WT SARS-CoV-2 S (GenBank: NC_045512) que también porta R683G (pSARS- CoV-2-SΔ19 R683G) cuando corresponda, según se indique. Las partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 se generaron como se describió anteriormente5,14. En resumen, se transfectaron células HEK293T con pNL4-3ΔEnv-nanoluc y pSARS-CoV-2-SΔ19, y las partículas se recogieron 48 h después de la transfección, se filtraron y almacenaron a -80 °C.

Se incubaron plasma de control negativo prepandémico diluido en serie cinco veces de donantes sanos (controles negativos técnicos, datos no mostrados), plasma de receptores de anticuerpos monoclonales vacunados y controles vacunados con ARNm, o anticuerpos monoclonales con virus pseudotipado de SARS-CoV-2 durante 1 hora a 37 ºC. Posteriormente, la mezcla se incubó con células HEK293T-ACE25 (para todos los ensayos de neutralización WT de anticuerpos monoclonales) o células HT1080Ace2 cl146 (para todos los ensayos de neutralización de plasma) durante 48 h, después de lo cual las células se lavaron con PBS y se lisaron con Luciferase Cell Culture Lysis 5X. reactivo (Promega). La actividad de luciferasa de Nanoluc en los lisados ​​se midió utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Nano-Glo (Promega) con el lector multimodo ClarioStar (BMG, v.5.70.R3). Las unidades de luminiscencia relativas se normalizaron con respecto a las derivadas de células infectadas con el virus pseudotipado del SARS-CoV-2 en ausencia de plasma o anticuerpos monoclonales. El título de neutralización medio máximo para plasma (NT50) o las concentraciones inhibidoras medio máxima y del 90 % para anticuerpos monoclonales (CI50 e CI90) se determinaron mediante regresión no lineal de cuatro parámetros (método de regresión de mínimos cuadrados sin ponderación; restricciones: superior=1 , abajo=0; en GraphPad Prism).

Se biotinilaron RBD o S del SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 purificado y marcado con Avi usando el kit Biotin-Protein Ligase-BIRA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Avidity) como se describió anteriormente5. Se biotiniló ovoalbúmina (Sigma-Aldrich, A5503-1G) utilizando el kit EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinilylation de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific). La ovoalbúmina biotinilada se conjugó con estreptavidina-BV711 para tipos de células individuales humanas (BD Biosciences, 563262) o con estreptavidina-BB515 para fenotipado (BD Biosciences, 564453). Para todos los experimentos con humanos y ratones, RBD se conjugó con estreptavidina-PE (BD Biosciences, 554061) y estreptavidina-AF647 (BioLegend, 405237)5,9.

La clasificación unicelular mediante citometría de flujo se describió anteriormente5. En resumen, se enriquecieron células mononucleares de sangre periférica para células B mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de células B de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, 130-101-638). Antes de la tinción, las células B enriquecidas se incubaron con un anticuerpo bloqueador de FcR (BD, 564220) en una dilución 1:200 en tampón de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (1x PBS, 2% FCS, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM ( EDTA)) durante 20 min en hielo. Posteriormente, las células se incubaron en tampón FACS con los siguientes anticuerpos antihumanos (todos en dilución 1:200): anti-CD20-PECy7 (BD Biosciences, 335793), anti-CD3-APC-eFluro 780 (Invitrogen, 47-0037 -41), anti-CD8-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0086-42), anti-CD16-APC-eFluor 780 (Invitrogen, 47-0168-41), anti-CD14-APC-eFluor 780 (Invitrogen , 47-0149-42) y Zombie NIR (BioLegend, 423105), y RBD y ovoalbúmina (Ova) marcados con fluoróforo durante 30 minutos en hielo. Se agregaron perlas de conteo AccuCheck (Life Technologies, PCB100) como se indica a cada muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se clasificaron células B individuales CD3-CD8-CD14-CD16-CD20 + Ova-RBD-PE + RBD-AF647+ en pocillos individuales de placas de 96 pocillos que contenían 4 µl de tampón de lisis (0,5 × PBS, ditiotreitol 10 mM, 3000 U ml). −1 inhibidores de ribonucleasa RNasin (Promega, N2615) por pocillo utilizando el sistema FACS Aria III y el software FACSDiva (Becton Dickinson) para la adquisición y FlowJo para el análisis. Las células clasificadas se congelaron en hielo seco y luego se almacenaron a −80 °C durante posterior transcripción inversa de ARN. Para el análisis del fenotipo de las células B, además de los anticuerpos anteriores, las células B también se tiñeron con los siguientes anticuerpos antihumanos (todos a una dilución de 1:200): anti-CD19-BV605 (BioLegend, 302244), anti- IgG-PECF594 (BD, 562538), anti-IgM-AF700 (BioLegend, 314538) y anti-CD38-BV421 (BioLegend, 303526).

Los ganglios linfáticos poplíteos de ratones se recogieron en tampón FACS (1x PBS, 2% FBS, EDTA 2 mM), se rompieron mecánicamente y se filtraron a través de un colador de 35 µM (Corning, 352235). Luego, las células se sometieron a rondas iterativas de tinción cada una durante 20 minutos en hielo (todos los anticuerpos se diluyeron a 1:200 a menos que se indique lo contrario): (1) CD16/32 anti-ratón (Mouse BD FC Block, BD Biosciences, 553142); (2) RBD conjugado con fluoróforo (ver arriba); (3) antígeno de activación de células anti-T y anti-B-FITC (BD Biosciences, 553666), anti-CD38-PB (BioLegend, 102720; dilución 1:100), anti-CD45R/B220-BV605 (BioLegend, 103244) , anti-CD4-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-0042-82), anti-CD8a-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-0081-82), anti-NK1.1-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-5941 -82), anti-F4/80-APC-eFluor780 (Invitrogen, 47-4801-82), anti-CD95-PE-Cy7 (BD Biosciences, 557653) y Zombie NIR (BioLegend, 423105, 1:1.000). Se agregaron perlas de conteo AccuCheck (Life Technologies, PCB100) a las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se clasificaron células individuales CD4-CD8a-NK1.1-F4/80-B220+CD38-GL7+CD95+ en el sistema BD FACSymphony S6 en placas de 96 pocillos que contenían 2-β-mercaptoetanol al 1% (Sigma-Aldrich) en tampón TCL. (Qiagen, 1031576) y posteriormente se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80 °C para la transcripción inversa del ARN.

Los anticuerpos humanos se identificaron y secuenciaron como se describió anteriormente5,39. En resumen, se transcribió de forma inversa el ARN de células individuales (SuperScript III Reverse Transcriptase, Invitrogen, 18080-044) y el ADNc se almacenó a -20 °C o se utilizó para la amplificación posterior de los genes variables IGH, IGL e IGK mediante PCR anidada. y secuenciación de Sanger. El análisis de secuencia se realizó utilizando MacVector (v.17.5.4) y Geneious Prime (v.2020.1.2 y v.2022.1.1). Los amplicones de la primera reacción de PCR se utilizaron como plantillas para la clonación independiente de secuencia y ligación en vectores de expresión de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales de ratón se secuenciaron y clonaron a partir de células B individuales clasificadas por FACS como se describió anteriormente40,41 con las siguientes modificaciones. En resumen, el ARN de células individuales en placas de 96 pocillos se purificó utilizando perlas magnéticas (RNAClean XP, Beckman Coulter, A63987). El ARN unicelular se eluyó de perlas magnéticas con 11 µl de solución que contenía 14,4 ng µl−1 de cebadores aleatorios (Invitrogen, 48190011), 0,5 % de IGEPAL CA-630 (10 % en H–O destilada, Sigma-Aldrich, I8896 -50ML) y 0,6 U μl-1 de inhibidor de RNasa (Promega, N2615) en agua libre de nucleasas (Qiagen, 129115), seguido de incubación a 65 °C durante 3 min. El ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa (SuperScript III Reverse Transcriptase 10,000 U, Invitrogen, 18080-044) y se almacenó a -20 ° C después de la adición de 10 μl de agua libre de nucleasas. La amplificación posterior de los genes variables de los anticuerpos IGH e IGK se logró mediante PCR anidada utilizando ADN polimerasa HotstarTaq (Qiagen, 203209), utilizando cebadores publicados previamente41 y las siguientes condiciones del termociclador para el hibridación (ver detalles a continuación), elongación (todos 72 ºC/55 s ) y número de ciclos: PCR1 (IGG, IGM e IGK): 46 °C/30 s/50 ciclos; PCR2 (IGG e IGM): 55 °C/30 s/50 ciclos; PCR2 (IGK): 46 °C/30 s/50 ciclos. Después de la purificación, los productos de PCR de cadena pesada y cadena ligera se secuenciaron con Sanger y posteriormente se analizaron utilizando MacVector y Geneious Prime (v.2022.1.1), así como el proceso de bioinformática que se detalla a continuación. Las secuencias de Ig de ratón se ordenaron como eBlocks (IDT) con homologías cortas para la clonación independiente de secuencia y ligación y se clonaron en vectores de expresión IGHG1 Fab e IGLK humanos como se describió anteriormente41. Todas las secuencias de plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger, y todos los anticuerpos monoclonales recombinantes (IgG de longitud completa derivada de células B de memoria humana y fragmentos Fab de IgG1 humana derivados de ratón marcados con His6) se produjeron y purificaron posteriormente como se describió anteriormente5,41. Para producir IgM pentaméricas, la clonación a partir de productos de PCR se realizó mediante secuenciación y clonación independiente de la ligadura como se describió anteriormente, excepto que el gen variable de IGH se clonó en un vector de expresión de Igμ (InvivoGen, pfusess-hchm3). Luego se expresaron IgM pentaméricas mediante transfección transitoria de células HEK293-6E con vectores que codifican la cadena J, la cadena ligera y la cadena pesada apropiadas en una proporción de 1:1,5:1,5. Las IgM secretadas se recogieron de los sobrenadantes celulares después de 6 días y se purificaron utilizando el kit POROS CaptureSelect IgM Affinity Matrix (Thermo Fisher Scientific, 1952890500). Las IgM purificadas por afinidad se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones máximas de IgM pentamérica se analizaron mediante SDS-PAGE, se combinaron y se intercambiaron con tampón en PBS utilizando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra de 100 kDa (Millipore).

Los ensayos BLI se realizaron como se describió anteriormente5,15,41 con modificaciones menores como se muestra a continuación. En resumen, utilizamos el instrumento ForteBio Octet Red (software ForteBio Data Acquisition v.11.1.3.25) a 30 °C con agitación a 1000 rpm. Las afinidades monoméricas de la IgG anti-SARS-CoV-2 RBD y los fragmentos Fab con RBD se derivaron mediante restando la señal obtenida de las trazas realizadas con el mismo IgG/Fab en ausencia de WT RBD. El análisis cinético utilizando un biosensor de proteína A (ForteBio, 18-5010) para IgG humanas se realizó de la siguiente manera: (1) línea de base: inmersión durante 60 s en tampón (1 × tampón Octet Kinetic, Sartorius, 18-1105); (2) carga: inmersión durante 200 s en una solución con IgG a 10 μg ml-1; (3) línea de base: inmersión durante 200 s en buffer; (4) asociación: inmersión durante 300 s en solución con WT RBD en tres concentraciones diferentes que van de 200 a 5 μg ml-1; (5) disociación: inmersión durante 600 s en buffer. El ajuste de curvas se realizó utilizando un modelo de unión rápido 1:1 y el software de análisis de datos de ForteBio. Las constantes medias de disociación en equilibrio (Kd) se determinaron promediando todas las curvas de unión que coincidían con el ajuste teórico con un valor R2 de ≥0,8. Para establecer la unión de anticuerpos de baja afinidad al antígeno multimerizado, se incubaron trímeros S biotinilados y estabilizados con 6P con estreptavidina recombinante (ACROBiosystems, STN-N5116) durante 30 minutos a temperatura ambiente, lo que dio como resultado hasta 12 restos de unión a RBD por molécula y analizado en el instrumento Octet Red (ForteBio) como se describe anteriormente, con la siguiente modificación: el paso de asociación (4) se realizó con el multímero S a 430 μg ml-1. Los ensayos de mapeo de epítopos se realizaron con un biosensor de proteína A (ForteBio, 18-5010), de acuerdo con el protocolo del fabricante "ensayo sándwich clásico" de la siguiente manera: (1) verificación del sensor: los sensores se sumergieron durante 30 s solo en tampón (tampón ForteBio, 18 -1105); (2) capturar el primer anticuerpo: los sensores se sumergieron durante 10 minutos con el anticuerpo 1 a 10 μg ml-1; (3) línea de base: los sensores se sumergieron durante 30 s solo en tampón; (4) bloqueo: los sensores se sumergieron durante 5 minutos con control de isotipo IgG (3BNC117) a 20 μg ml-1; (5) línea de base: los sensores se sumergieron durante 30 s solo en tampón; (6) asociación de antígeno: los sensores se sumergieron durante 5 minutos con RBD a 20 μg ml-1; (7) línea de base: los sensores se sumergieron durante 30 s solo en tampón. (8) Anticuerpo de asociación b2: los sensores se sumergieron durante 5 minutos con el anticuerpo 2 a 10 μg ml-1. La prueba de afinidad de fragmentos Fab de IgG1 humana derivados de células B del centro germinal de ratón se realizó utilizando los mismos pasos y ajustes del instrumento Octet Red (ForteBio) que para los anticuerpos IgG de longitud completa derivados de memoria humana (ver arriba) con las siguientes modificaciones: Se capturaron fragmentos Fab monoclonales a 50 μg ml-1 en biosensores FAB2G (Sartorius 18-5125) para el paso 2; Se añadió RBD monovalente en concentraciones que oscilaban entre 30 y 120 μg ml-1 en el paso 4. Se definió que los fragmentos Fab de unión con afinidades mensurables tenían cinéticas de asociación y disociación biológicamente plausibles (es decir, podían asociarse a la saturación en el biosensor en el paso 2 y que muestra una asociación y disociación discernibles del antígeno después de los pasos (4) y (5)), así como un valor de Kd calculado que coincidía con el ajuste teórico con un valor R2 de ≥0,75. Las afinidades de los fragmentos Fab que no fueron capturados en el biosensor hasta la saturación en la concentración probada no pudieron resolverse y se excluyeron de análisis adicionales (marcados como N/D en la Tabla complementaria 6). En todos los casos, el ajuste de la curva se realizó utilizando el software de análisis de datos ForteBio Octet (ForteBio Data Analysis HT v.11.1.3.50).

Las secuencias de anticuerpos se recortaron según la calidad y se anotaron utilizando Igblastn v.1.14 con el sistema de delimitación de dominios IMGT. La anotación se realizó sistemáticamente utilizando el kit de herramientas Change-O (v.0.4.540)42. La clonalidad de las cadenas pesada y ligera se determinó utilizando DefineClones.py implementado por Change-O (v.0.4.5)42. El script calcula la distancia de Hamming entre cada secuencia del conjunto de datos y su vecino más cercano. Posteriormente, las distancias se normalizan para tener en cuenta las diferencias en la longitud de la secuencia de unión y la clonalidad se determina en función de un umbral de corte de 0,15. Posteriormente se emparejaron las cadenas pesadas y ligeras derivadas de la misma célula y se asignaron clonotipos en función de sus genes V y J utilizando scripts R y Perl personalizados. Todos los scripts y los datos utilizados para procesar secuencias de anticuerpos están disponibles públicamente en GitHub (https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline2_timepoint_v2). La distribución de frecuencia de los genes V humanos en los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 de este estudio (Datos ampliados, figuras 4f-h) se comparó con 131,284,220 secuencias de IgH e IgL generadas en la ref. 43 y descargado de cAb-Rep44, una base de datos de clonotipos BCR humanos compartidos disponible en línea (https://cab-rep.c2b2.columbia.edu/). Sobre la base de los 108 genes V distintos que componen las 417 secuencias analizadas del repertorio de Ig de los individuos descritos en este estudio (353 secuencias aisladas de 5 receptores de anticuerpos monoclonales y 65 secuencias de IgM aisladas de 9 individuos de control vacunados (para secuencias de IgG aisladas de los controles, ver referencias 9, 11), seleccionamos las secuencias de IgH e IgL de la base de datos que están parcialmente codificadas por los mismos genes V y las contamos de acuerdo con la región constante. Las frecuencias que se muestran en los datos extendidos, Fig. 4f– h son relativos a la fuente y al isotipo analizados. Utilizamos pruebas binomiales bilaterales para verificar si el número de secuencias pertenecientes a un gen IGHV o IGLV específico en el repertorio era diferente según la frecuencia del mismo gen IGV en la base de datos. Los valores de P ajustados se calcularon utilizando la corrección por tasa de descubrimiento falso. Las diferencias significativas se indican con asteriscos. Las mutaciones somáticas de nucleótidos y la longitud de la región determinante de la complementariedad (CDR3) se determinaron utilizando scripts personalizados de R y Perl. Para la cuantificación de mutaciones somáticas, las secuencias de nucleótidos de IGHV e IGLV se alinearon con sus líneas germinales más cercanas utilizando Igblastn y se consideró que el número de diferencias era el número de mutaciones de nucleótidos.

Las figuras fueron ordenadas en Adobe Illustrator 2022.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos se proporcionan en las tablas complementarias 1 a 6. Los datos de secuenciación sin procesar y los scripts informáticos asociados con las Figs. 2 y 4 y datos ampliados Figs. 3 y 7 se han depositado en GitHub (https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline2_timepoint_v2). Este estudio también utiliza datos de 'Una base de datos pública de secuencias de receptores de células B ingenuas y de memoria' (https://doi.org/10.5061/dryad.35ks2), el Banco de datos de proteínas (6VYB y 6NB6), cAb-Rep ( https://cab-rep.c2b2.columbia.edu/), el archivo de lectura de secuencias (SRP010970) y de 'Alta frecuencia de clonotipos compartidos en repertorios de receptores de células B humanas' (https://doi.org/10.1038/s41586 -019-0934-8).

El código informático para procesar las secuencias de anticuerpos está disponible en GitHub (https://github.com/stratust/igpipeline/tree/igpipeline2_timepoint_v2).

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Agradecemos a todos los participantes del estudio que dedicaron su tiempo a nuestra investigación; el personal de enfermería del Hospital de la Universidad Rockefeller y la Oficina de Apoyo a la Investigación Clínica y el personal de enfermería; todos los miembros del laboratorio MCN para discusiones; M. Jankovic y G. Scrivanti por el apoyo de laboratorio; T. Eisenreich por su ayuda con el manejo de colonias de ratones y ayuda técnica; y K. Gordon por la clasificación de células. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH P01-AI138398-S1 y 2U19-AI111825 para MCN; R37-AI64003 a PDB y R01-AI78788 a TH; y 3UM1AI126620-5S1 a M. Caskey. DS-B. cuenta con el apoyo parcial del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (programa de Premios de Ciencias Clínicas y Traslacionales de los NIH, subvención UL1-TR001866) y el Fondo Shapiro-Silverberg para el Avance de la Investigación Traslacional. ZW recibió el apoyo del Centro Maurice R. y Corinne P. Greenberg para el Avance de la Investigación Traslacional, en parte mediante la subvención UL1 TR001866 del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, programa de Premios de Ciencias Clínicas y Traslacionales de los NIH. FM contó con el apoyo de la beca Bulgari Women & Science Fellowship en la investigación de COVID-19. PDB y MCN son investigadores del Instituto Médico Howard Hughes (HHMI). Este artículo está sujeto a la política de acceso abierto a las publicaciones del HHMI. Los jefes de laboratorio del HHMI han otorgado previamente una licencia CC BY 4.0 no exclusiva al público y una licencia sublicenciable al HHMI en sus artículos de investigación. De conformidad con esas licencias, el manuscrito de este artículo aceptado por el autor puede estar disponible gratuitamente bajo una licencia CC BY 4.0 inmediatamente después de su publicación.

Los siguientes autores contribuyeron igualmente: Dennis Schaefer-Babajew, Zijun Wang, Frauke Muecksch, Alice Cho

Laboratorio de Inmunología Molecular, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Dennis Schaefer-Babajew, Zijun Wang, Alice Cho, Maximilian Loewe, Melissa Cipolla, Raphael Raspe, Brianna Johnson, Victor Ramos, Martina Turroja, Katrina G. Millard, Juan Dizon, Irina Shimeliovich, Kai-Hui Yao, Thiago Y. Oliveira, Anna Gazumyan, Christian Gaebler, Marina Caskey y Michel C. Nussenzweig

Laboratorio de Retrovirología, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Frauke Muecksch, Marie Canis, Justin DaSilva, Fabian Schmidt, Leander Witte, Paul D. Bieniasz y Theodora Hatziioannou

Instituto Médico Howard Hughes, Nueva York, NY, EE. UU.

Anna Gazumyan, Paul D. Bieniasz y Michel C. Nussenzweig

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DS-B. y MCN conceptualizaron el estudio. DS-B., ZW, FM, AC, PDB, TH y MCN concibieron, diseñaron y analizaron experimentos. DS-B., CG y M. Caskey diseñaron protocolos clínicos. DS-B., ZW, FM, AC, ML, M. Cipolla, RR, M. Canis, J. DaSilva., FS, LW y K.-HY realizaron experimentos. BJ y AG produjeron anticuerpos. MT, KGM, IS, J. Dizon, CG y M. Caskey reclutaron participantes, llevaron a cabo protocolos clínicos y procesaron muestras. VR y TYO realizaron análisis bioinformáticos. DS-B. y MCN escribió el manuscrito con el aporte de todos los autores.

Correspondencia a Paul D. Bieniasz, Theodora Hatziioannou, Marina Caskey o Michel C. Nussenzweig.

La Universidad Rockefeller ha presentado una solicitud de patente provisional en relación con este trabajo, en el que MCN figura como inventor (patente estadounidense 63/021,387). La patente ha sido autorizada por la Universidad Rockefeller a Bristol Meyers Squib. PDB ha recibido una remuneración de Pfizer por servicios de consultoría relacionados con las vacunas contra el SARS-CoV-2.

Nature agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

af, Unión de anticuerpos monoclonales a formas mutantes de RBD. ac, Los gráficos muestran la unión de anticuerpos dependiente de la concentración a (a) WT, (b) R436S/E484K y (c) N440K/E484K RBD mediante C144, C135 y Clase 1 (C105), Clase 2 (C952), Clase 3. (C881) y Clase 4 (C149)5,6,8,26. df, los gráficos muestran la unión de plasma de donante sano prepandémico dependiente de la concentración a (d) WT, (e) R436S/E484K y (e) N440K/E484K RBD en presencia (púrpura) o ausencia (líneas de puntos) de 100 mg ml −1 de C135 y C144. La adición de C144 y C135 al plasma aumenta la actividad de unión del plasma contra el WT pero no contra los 2 RBD mutantes. gh, los paneles muestran la correlación de los niveles séricos de C135-LS (g) y C144-LS (h) el día 84 después de la administración (alrededor de los momentos de la vacunación como se ve en la Fig. 1b) con el anticuerpo IgG anti-WT RBD total. título de los receptores de mAb (n = 18) después de una (círculos verdes vacíos) y dos dosis (puntos verdes sólidos) de vacunación con ARNm. Significancia estadística en g (r = 0,9097 y r = 0,5891 con p < 0,0001 y p = 0,0101 para vax1 y vax2, respectivamente) y h (r = 0,8772 y r = 0,5483 con p < 0,0001 y p = 0,0185 para vax1 y vax2, respectivamente) se determinó utilizando la estadística de correlación de Pearson de dos colas. Todos los experimentos se realizaron al menos por duplicado.

a, Los gráficos muestran curvas de neutralización dependiente de la concentración para los pseudovirus del SARS-CoV-2 mediante anticuerpos monoclonales. C144 (rojo), C135 (azul) y su combinación equimolar (púrpura). b, Neutralización con plasma prepandémico (cuadrados) de pseudovirus WT o R346S/Q493K o R346S/N440K/E484K en ausencia o presencia de 5 (círculos discontinuos de color violeta) o 100 µg ml-1 (círculos sólidos de color violeta) de C135 y C14414 . cd, Como en (b), pero para plasma de convaleciente con actividad neutralizante intermedia (c, COV157)12 o fuerte (d, COV31)12. Las líneas horizontales en todos los paneles indican la neutralización media máxima. e, Título neutralizante medio máximo en plasma (NT50) contra VIH-1 pseudotipado con BA.4/5 S38. Cada punto representa un individuo del grupo de control (n = 31, azul) o del grupo receptor de mAb (n = 18, verde). Las barras horizontales rojas y los números rojos representan valores medianos. La significación estadística se determinó utilizando el método Mann-Whitney de dos colas. Para el anuncio, los símbolos individuales representan la media de dos experimentos independientes y las barras de error representan la desviación estándar. Todos los experimentos se realizaron al menos por duplicado.

a, Estrategia de activación para el fenotipado por citometría de flujo. La activación se realizó en linfocitos individuales que eran CD19+ y CD20+, y CD3- CD8- CD16- Ova- sin absorción de colorante vivo-muerto (L/D). Las células específicas de antígeno fueron aquellas con doble unión a Wuhan-Hu1 RBD-PE y RBD-AF647. Se utilizaron anti-IgG y -IgM para fenotipar células B duales marcadas con RBD. b,c, Gráficos representativos de citometría de flujo de células B de memoria de unión a RBD de Wuhan Hu-1 de receptores de mAb después de una y dos dosis de vacunación (b) y de donantes de salud prepandémicos (c) que sirven como controles negativos. Los números en la puerta RBD indican el porcentaje de células con doble etiqueta RBD de la puerta principal (ver a). Los gráficos de citometría de flujo correspondientes y la estrategia de selección para los controles vacunados se pueden encontrar en 11. de, Número de células B de memoria específicas de IgG- (d) e IgM (e) WT RBD por 10 millones de células B CD20+. Cada punto representa un individuo del receptor de mAb (verde, n = 18) y del grupo de control (azul, n = 10)9,11. Las barras rojas horizontales indican valores medianos. fi, los paneles muestran la correlación de los niveles séricos de C135-LS (f, g) y C144-LS (h,i) en el día 84 después de la administración (alrededor de los momentos de vacunación como se ve en la Fig. 1b) con el porcentaje de WT. Células B de memoria específicas de RBD que expresan IgG (f, h) o IgM (g, i) después de dos dosis de vacuna, según lo evaluado mediante citometría de flujo. Los puntos verdes representan receptores individuales de mAb (n = 18). La significación estadística se determinó utilizando el método de Mann-Whitney de dos colas para d y e, y el estadístico de correlación r de Pearson se utilizó para fi.

ab, paneles que muestran la expresión superficial de IgG (a) e IgM (b) de células de memoria anti-RBD exactamente como en las figuras 2b y c, pero con los 5 individuos representativos de quienes se clasificaron posteriormente las células resaltados en amarillo. c, Estrategia de activación para la clasificación unicelular de células B de memoria específicas de RBD. Se clasificaron las células CD20+ CD3− CD8− CD16− Ova− con doble etiqueta (RBD-PE+/-AF647+). d, Los gráficos representativos de citometría de flujo muestran células de unión a RBD que se separaron de los 5 receptores de mAb. e, Los gráficos circulares muestran la distribución de secuencias de anticuerpos derivadas de células aisladas de 10 individuos de control vacunados después de vax2. El panel superior muestra IgM y el panel inferior muestra secuencias de IgG9,11. El número en el círculo interior indica el número de secuencias analizadas para el individuo indicado sobre el círculo. Las rodajas coloreadas en tonos de azul indican células que están expandidas clonalmente (los mismos genes IGHV e IGLV, con CDR3 muy similares). El tamaño del sector circular es proporcional al número de secuencias relacionadas clonalmente. El contorno negro y el valor de porcentaje indican la frecuencia de secuencias expandidas clonalmente detectadas dentro de un individuo. Las áreas circulares blancas indican la proporción de secuencias aisladas una sola vez. Para C005, no hubo transcripciones de IgM amplificadas en el momento analizado. fh, Comparación de la distribución de frecuencia del uso del gen V para IgH e IgL entre anticuerpos aislados de receptores de mAb vacunados con ARNm (este estudio) y controles9,11, después de vax2, y de la base de datos de clonotipos compartidos de anticuerpos humanos de Soto et al. .43. Los gráficos muestran la abundancia relativa de los genes humanos IGHV (f), IGKV (g) e IGLV (h) dentro de la base de datos del gen V humano (en gris, acceso al archivo de lectura de secuencias SRP010970), anticuerpos aislados de receptores de mAb (en verde) o vacunados. controles (en azul). Los colores de las estrellas indican niveles de significancia estadística para las siguientes comparaciones de frecuencia: negro – controles vacunados versus base de datos; rojo: receptores de mAb frente a base de datos; azul: receptores de mAb frente a controles vacunados.

ab, los paneles representan la unión de WT RBD y la actividad neutralizante del pseudotipo WT SARS-CoV-2 S de paneles representativos de anticuerpos monoclonales derivados de células B de memoria específicas de RBD que expresan IgM expresadas como IgG1 humana (IgG, como en la Fig. 3a). c) o IgM pentamérica (IgM5). a, el panel muestra WT RBD EC50 de 15 anticuerpos monoclonales aislados de receptores de mAb vacunados (consulte también la Tabla complementaria 4). El área sombreada en gris entre las líneas de puntos horizontales indica anticuerpos con EC50 >10 µg ml-1 (unión deficiente) y anticuerpos sin unión agrupados arbitrariamente en 10 y 20 µg ml-1, respectivamente. b, Los gráficos muestran las IC50 de 2 anticuerpos de control derivados de IgM (que cubren una amplia gama de actividad neutralizante) en azul y 15 anticuerpos monoclonales derivados de IgM de receptores de mAb (como en a) en verde, expresados ​​como IgG1 humana (IgG) o pentamérica. IgM (IgM5). Para ambos paneles (a, b), los diagramas de anillos resumen la fracción de anticuerpos en la categoría indicada entre todos los analizados (número rodeado por un círculo). Las barras horizontales rojas y los números indican valores medianos. Para el panel a, la significación estadística se determinó utilizando la prueba de rango de pares emparejados de Wilcoxon de dos colas para comparar las diferencias entre los mismos anticuerpos monoclonales expresados ​​como IgG o IgM pentamérica, y se utilizó la estadística de contingencia de Chi-cuadrado para comparar distribuciones categóricas de los gráficos de anillos. .

anuncio, trazas BLI de anticuerpos analizados para determinar la competencia con anticuerpos de referencia de clase. Los trazos muestran la curva de asociación inicial (fase de captura de antígeno del anticuerpo primario) y la posterior adición de anticuerpos secundarios de clase desconocida. Las líneas negras finas y sólidas representan anticuerpos aislados de receptores de mAb o controles vacunados. Las líneas discontinuas gruesas son rastros de autocompetencia de C105 (verde en a), C144 (rojo en b), C135 (azul en c) y C2172 (morado en d) para las clases 1 a 4, respectivamente. e, Mapa de calor de la inhibición relativa de la unión del anticuerpo secundario a los complejos de anticuerpo de captura preformado-RBD (gris = sin unión, rojo = unión intacta, naranja = indeterminado). El panel izquierdo muestra anticuerpos de receptores de mAb, mientras que el panel derecho muestra anticuerpos IgM de controles vacunados aislados en este estudio (ambos después de vax2). Los detalles sobre los anticuerpos IgG aislados de controles vacunados se pueden encontrar en 9,11. f, trazas BLI que definen C2172 como Clase 4. C2172 es el anticuerpo primario/de captura (en púrpura discontinuo). La adición de los anticuerpos definidores de clase conocidos C105 (en verde, Clase 18), C144 (en rojo, Clase 28), C135 (en azul, Clase 38) y C118 (en naranja, Clase 1/427) establece al C2172 como un anticuerpo auténtico de Clase 4.

a, Estrategia de activación para el fenotipado por citometría de flujo de células B del centro germinal aisladas de los ganglios linfáticos de drenaje (poplíteos) de ratones WT C57BL/6 inmunizados con SARS-Cov-2 RBD recombinante 11 días antes (como se ilustra en la Fig. 4a). La activación se realizó en linfocitos individuales que eran B220+ y CD4- CD8a- NK1.1- F4/80- (linaje negativo) sin absorción de colorante vivo-muerto (L/D). Las células B del centro germinal fueron aquellas que eran CD38− GL7+ CD95 (Fas)+. Las células específicas de antígeno fueron aquellas con doble unión a Wuhan-Hu1 RBD-PE y RBD-AF647. b, Gráficos representativos de citometría de flujo de células B del centro germinal de unión a RBD Hu-1 de Wuhan de ratones que habían recibido la combinación de C135 y C144 (grupo mAb anti-RBD) o los anticuerpos de control anti-VIH irrelevantes 3BNC117 y 10– 1074 (controles de mAb anti-VIH) un día antes de la inmunización, indicando el porcentaje de células de unión dentro de la puerta respectiva. cd, Los paneles muestran el número total de células B del centro germinal CD38− GL7+ CD95 (Fas)+ (c) y células B del centro germinal de unión a RBD (d) aisladas de mAb anti-RBD pretratado (n = 6, verde) y ratones de control (n = 6, azul), correspondiendo cada punto a un ratón individual. e, Niveles de hipermutación somática (SHM) de anticuerpos monoclonales derivados de células B del centro germinal mostrados como sustituciones combinadas de nucleótidos de región variable de cadena pesada y ligera más uno (IGVH+IGVL+1), donde cada punto representa una secuencia de anti- Ratones pretratados con RBD mAb (verde) o controles (azul). Los gráficos de anillos debajo de cada columna muestran la fracción de secuencias sin (IGVH+IGVL+1 = 1) frente a cualquier (IGVH+IGVL+1 > 1) SHM entre todas las secuencias analizadas (número encerrado en un círculo) para el grupo respectivo. f, Porcentaje de secuencias que pertenecen a clones, definidas como 2 o más secuencias con los mismos genes IGHV e IGLV y con CDR3 muy similares, entre todas las secuencias obtenidas del animal respectivo (como en la Fig. 4d). Cada punto representa un ratón individual del mAb anti-RBD (n = 6, verde) o del grupo de control (n = 6, azul). g, Constantes de afinidad (Kd) de Fabs derivados de células B del centro germinal para WT SARS-CoV-2 RBD, según lo establecido a partir de la interacción monovalente de Fabs con monómeros de RBD por BLI (ver también Fig. 4f-i, Tabla complementaria 6 y métodos). Cada punto representa un único Fab del mAb anti-RBD (n = 8, verde) o del grupo de control (n = 22, azul). Las barras horizontales rojas (cg) y los números (e, g) indican los valores medianos (c, d, f, g) y medios (e). La significación estadística se determinó utilizando la prueba de Mann-Whitney de dos colas para cg d, y se utilizó la prueba exacta de Fisher de dos colas para probar la contribución relativa de secuencias mutadas y no mutadas en e.

Descripciones de las tablas complementarias 1 a 6.

Características de la cohorte.

Características individuales de los participantes.

Secuencias de anticuerpos RBD anti-SARS-CoV-2 humanos.

Secuencias, unión de RBD ELISA, neutralización, afinidad y epítopos de anticuerpos RBD anti-SARS-CoV-2 humanos recombinantes clonados.

Secuencias de anticuerpos de células B del centro germinal de ratón.

Secuencias y afinidades de unión de fragmentos Fab del centro germinal de ratón monoclonal recombinante clonado.

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Schaefer-Babajew, D., Wang, Z., Muecksch, F. et al. La retroalimentación de anticuerpos regula la memoria inmune después de la vacunación con ARNm del SARS-CoV-2. Naturaleza 613, 735–742 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05609-w

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Recibido: 04 de junio de 2022

Aceptado: 30 de noviembre de 2022

Publicado: 06 de diciembre de 2022

Fecha de emisión: 26 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05609-w

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